利用TALEN和CRISPR-Cas9技術構建甲型血友病小鼠模型.pdf

1、人類甲型血友病是FⅧ基因突變所產(chǎn)生的罕見遺傳性疾病。甲型血友病小鼠模型可用于該疾病的藥物研發(fā)、預防和治療手段等研究。已有基于ES同源重組制作的基因敲除小鼠模型，但該方法效率低、周期長、成本高。隨著ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技術的發(fā)展，尤其是TALEN和CRISPR/Cas9技術具有高效率、易操作、短周期、低費用等優(yōu)勢，成為應用最廣泛的基因編輯技術，使制備基因敲除小鼠模型更為便捷。本課題分別通過TALEN和CRISPR/C

2、as9技術敲除小鼠的FⅧ基因，構建甲型血友病小鼠模型。在細胞水平和動物個體上比較了兩種技術的效率，驗證了敲除的FⅧ基因在后裔中傳遞的規(guī)律，并分析了基因敲除小鼠的表型。
　　以小鼠FⅧ基因第三外顯子為靶向，構建TALEN核酸酶表達載體。細胞實驗顯示5對TALEN組合(T1～T5)中只有2對(T2、 T5)發(fā)生基因編輯，突變率分別為16％和38％。動物實驗顯示將5對TALEN組合的mRNA分別注射至62、145、112、89、119枚

3、胚胎，獲得57、140、92、81、114枚存活胚胎并移植至受體，出生10、39、26、0、28只小鼠。T7EI檢測和測序驗證，T2和T5組各出現(xiàn)1只突變小鼠，F(xiàn)0代突變率分別為2.56％和3.57％。
　　gRNA（位于TALEN的同一靶向）與Cas9載體連接后轉染到細胞，發(fā)現(xiàn)3條gRNA(CF8-1、CF8-2、CF8-3)均能引導Cas9核酸酶對細胞基因組的編輯，效率分別為50.4％、67.3％、67.9％。其中2條gRNA

4、存在脫靶現(xiàn)象:(1) CF8-2導致3個預測靶點的突變，分別為14.1％、6％、7％;(2) CF8-3導致2個預測靶點的突變，分別為27.8％、12％。動物實驗中將三條轉錄的gRNA和Cas9 mRNA分別注射至189、119、139枚胚胎，獲得164、109、106枚存活胚胎，出生12、8、8只小鼠。T7EI酶切和測序驗證，CF8-2和CF8-3出現(xiàn)突變小鼠各2只，突變效率均為25％。CF8-2介導的基因敲除小鼠(I60)出現(xiàn)2個脫

5、靶突變。
　　突變小鼠后裔檢測發(fā)現(xiàn)，T5組的F1、F2和F3的陽性率分別為20.0％、53.8％、72.7％;CF8-2組的F1和F2的陽性率分別為50％、80％;CF8-3組的F1、F2和F3的陽性率分別為22.2％、46.2％。
　　雜合子雌鼠的活化部分凝血酶原時間（APTT）檢測結果與野生型的比較具有差異顯著，突變雄鼠的APTT與野生型的比較具有差異極顯著，而凝血酶原時間(PT)檢測結果顯示均與野生型無顯著差異。Wes