應(yīng)用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)獲得高直鏈淀粉馬鈴薯.pdf

1、馬鈴薯直鏈淀粉廣泛用于醫(yī)藥、食品等工業(yè)領(lǐng)域，也是生產(chǎn)抗性淀粉的重要原料。現(xiàn)有馬鈴薯品種直鏈淀粉含量?jī)H為總淀粉含量的25％左右，且直鏈淀粉分離工序損耗大得率低。因此，創(chuàng)造培育高直鏈淀粉含量的馬鈴薯品種對(duì)于促進(jìn)我國(guó)馬鈴薯淀粉加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。
　　CRISPR-Cas9技術(shù)能夠利用單鏈RNA引導(dǎo)Cas9蛋白酶對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯，是近年來新興的基因編輯技術(shù)，具有高效便捷、多位點(diǎn)同時(shí)編輯以及可剔除篩選標(biāo)記等優(yōu)勢(shì)。
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2、E基因編碼馬鈴薯支鏈淀粉合成途徑的關(guān)鍵酶，具有SBEⅠ和SBEⅡ兩個(gè)亞型。本研究利用CRISPR技術(shù)敲除兩個(gè)SBE基因，以期獲得高直鏈淀粉含量的馬鈴薯新品種。試驗(yàn)以SBEⅠ和SBEⅡ蛋白功能結(jié)構(gòu)域第9個(gè)外顯子20bp序列為靶標(biāo)，AtU3b和AtU6-1分別啟動(dòng)兩個(gè)sgRNA，CaMV35S為Cas9蛋白啟動(dòng)子，構(gòu)建pYLCRISPR/Cas9-MTdi-SBEⅠ-ⅡgRNA載體。通過農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化獲得44個(gè)馬鈴薯轉(zhuǎn)化株，PCR、測(cè)序鑒定

3、獲得36個(gè)陽性轉(zhuǎn)化株。靶序列測(cè)序結(jié)果表明，有5株在SBEⅠ靶位點(diǎn)上出現(xiàn)突變，1株在SBEⅡ靶位點(diǎn)上出現(xiàn)突變，共出現(xiàn)10種突變類型，包括1bp的插入突變和2-18bp的缺失突變，最高突變率為61.9％。未檢測(cè)到同時(shí)編輯SBEⅠ和SBEⅡ兩個(gè)靶位點(diǎn)的馬鈴薯轉(zhuǎn)化株。測(cè)產(chǎn)結(jié)果表明，除SBEⅡ-1以外，其他轉(zhuǎn)化株的結(jié)薯數(shù)和產(chǎn)量與對(duì)照相比均無顯著變化。淀粉含量測(cè)定結(jié)果表明馬鈴薯轉(zhuǎn)化株直鏈淀粉含量均無顯著上升。
　　分析影響基因編輯效果的因素，