CRISPR-Cas9靶向編輯技術(shù)的優(yōu)化及其在干細(xì)胞中的應(yīng)用.pdf

1、CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)發(fā)展，為人類疾病尤其是罕見遺傳病的基因治療提供了更有利的技術(shù)平臺，為精準(zhǔn)醫(yī)療提供了新策略。如何最大限度地降低和評估脫靶效應(yīng)、提高其在干細(xì)胞中的基因編輯效率，是CRISPR/Cas9系統(tǒng)走向臨床應(yīng)用的前提和關(guān)鍵。
　　本論文借助細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂(DSBs)后自發(fā)進(jìn)行的非同源末端連接(NHEJ)或同源介導(dǎo)的雙鏈修復(fù)(HDR)兩種機(jī)制，將帶有目標(biāo)基因序列向?qū)NA（gRNA）的一個(gè)或多個(gè)C

2、RISPR/Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入人的細(xì)胞系和干細(xì)胞中，誘發(fā)DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而誘發(fā)基因序列的插入、修飾和缺失，提高靶向編輯的效率和準(zhǔn)確性;同時(shí)利用整合酶缺陷型慢病毒載體(IDLVs)能夠優(yōu)先識別DNA雙鏈斷裂的特點(diǎn)，對CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行了評估，并優(yōu)化了干細(xì)胞中的基因編輯效率。
　　第1章 CRISPR/Cas9系統(tǒng)中g(shù)RNA脫靶效應(yīng)評估新方法的建立
　　近年來，CRISPR/Cas9系統(tǒng)廣泛地應(yīng)用于動(dòng)植

3、物的基礎(chǔ)研究中，更有望在未來應(yīng)用于臨床疾病治療。而脫靶效應(yīng)的存在始終是一個(gè)后患，已有的基于脫靶位點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)分析工具及體外驗(yàn)證方法往往無法體現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)脫靶情況，為了更安全、更精準(zhǔn)的應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對經(jīng)過基因編輯后的細(xì)胞進(jìn)行全面的脫靶位點(diǎn)篩查，顯得非常的重要。已有文獻(xiàn)報(bào)道，線性的雙鏈IDLV基因組能夠識別經(jīng)過ZFNs系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的雙鏈斷裂，并通過非同源末端連接的修飾方式，整合到雙鏈斷裂位點(diǎn)，進(jìn)而用于檢測ZFNs系統(tǒng)的脫靶效

4、應(yīng)。我們將其創(chuàng)新性的應(yīng)用在CRISPR/Cas9脫靶位點(diǎn)的全基因組篩查中。
　　針對兩個(gè)突變后會導(dǎo)致疾病的靶基因，WAS綜合征基因(WAS)和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因（TAT），分別設(shè)計(jì)了3個(gè)gRNAs及一對TALEN作為比較。經(jīng)過CRISPR/Cas9或TALEN轉(zhuǎn)染過的HEK293T細(xì)胞，第二天轉(zhuǎn)導(dǎo)入攜帶氨基糖苷類抗生素——嘌呤霉素(puromycin)篩選標(biāo)記的IDLV病毒，經(jīng)篩選后收集陽性克隆的全基因組DNA，利用非限制性(n

5、r)線性擴(kuò)增介導(dǎo)的PCR(LAM-PCR)結(jié)合深度測序(deep sequencing)的方法，定位陽性細(xì)胞全基因組中成簇的IDLV插入位點(diǎn)(CLISs)，并對各位點(diǎn)進(jìn)行分析。
　　發(fā)現(xiàn)由簡短的gRNA識別靶向基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，其脫靶情況差異很大;當(dāng)gRNA比識別位點(diǎn)的DNA序列多一到兩個(gè)或者少一到兩個(gè)堿基時(shí)，若能在gRNA與DNA序列結(jié)合時(shí)形成凸起(bulge)，這樣的脫靶位點(diǎn)仍然能夠產(chǎn)生雙鏈斷裂，像這種表面上存

6、在大于4個(gè)錯(cuò)配堿基的錯(cuò)配位點(diǎn)，目前的網(wǎng)絡(luò)運(yùn)算法則是無法預(yù)測到的。
　　本研究證實(shí)并檢測了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶問題。該方法非常靈敏，可以檢測到切割效率不低于1％的脫靶位點(diǎn)，雖然無法識別全部的脫靶位點(diǎn)，此方法卻是在全基因組水平上無偏的篩查。作為一種生物學(xué)的分析方法，該方法對CRISPR/Cas9系統(tǒng)的改進(jìn)提供了新思路與評測平臺。
　　第2章多能干細(xì)胞中CRISPR/Cas9介導(dǎo)的高效率的同源重組修飾
　　多能干

7、細(xì)胞(PSCs)如胚胎干細(xì)胞(ESCs)和誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(iPSCs)可用于疾病模型的建立，為研究發(fā)育生物學(xué)、疾病的病理機(jī)制提供了一個(gè)可以在培養(yǎng)皿中操作的平臺。攜帶疾病基因的PSCs可分化為疾病特異性的細(xì)胞或組織，進(jìn)行高通量毒理/藥效篩選，有望填補(bǔ)動(dòng)物模型與臨床試驗(yàn)的中間環(huán)節(jié)，節(jié)約藥物開發(fā)成本。以往的研究中，在人PSCs中進(jìn)行準(zhǔn)確基因編輯的效率很低，本研究旨在提高人PSCs中的基因定點(diǎn)修飾效率。
　　CRISPR/Cas9系統(tǒng)

8、可以在目標(biāo)基因誘發(fā)雙鏈斷裂，存在足夠模板序列的情況下，可促使細(xì)胞通過同源重組的方式進(jìn)行準(zhǔn)確編輯。依據(jù)此原理，針對WAS基因第6個(gè)內(nèi)含子的高突變位點(diǎn)區(qū)域，設(shè)計(jì)了2個(gè)gRNAs，結(jié)合IDLV攜帶的帶有篩選標(biāo)記的模板序列，對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行準(zhǔn)確的基因修飾。
　　發(fā)現(xiàn)通過IDLV攜帶模板序列的方法，經(jīng)篩選后，同源重組的正確率效率高達(dá)50％;推測并驗(yàn)證了晶狀體上皮源性生長因子(LEDGF/p75)，作為細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)同源重組修復(fù)方式的主要蛋白，可與

9、IDLV作用元件中的整合酶(IN)相結(jié)合，將模板序列拉到雙鏈斷裂位點(diǎn)，進(jìn)而促進(jìn)同源重組修復(fù)的發(fā)生。
　　本研究優(yōu)化了人PSCs中精確基因編輯的效率，并首次提出并驗(yàn)證了LEDGF/p75蛋白在IDLV攜帶模板序列促進(jìn)同源重組過程中的作用。
　　第3章造血干細(xì)胞中CRISPR/Cas9介導(dǎo)的靶向刪除在β-globin疾病治療中的應(yīng)用
　　β地中海貧血(β-thalassemia)和鐮刀型貧血癥(SCD)兩種β-globin

10、異常疾病，是研究得比較清楚的兩種單基因遺傳性疾病。都是由于β-globin珠蛋白亞基突變而導(dǎo)致的成人血紅蛋白(HbA)異常，進(jìn)而影響血紅蛋白的功能。臨床上發(fā)現(xiàn)，病情的嚴(yán)重程度與患者自身胎兒血紅蛋白(HbF)的表達(dá)水平密切相關(guān)，因此可以通過增加患者體內(nèi)HbF的含量來緩解β-globin疾病的癥狀。以往的研究發(fā)現(xiàn)，BCL11A基因第二個(gè)內(nèi)含子中一段約10kb的DNA序列，在正常人紅系發(fā)育過程中，可以特異性增強(qiáng)BCL11A基因的表達(dá)，從而抑制

11、了HbF中的組成元件——γ-globin的表達(dá)。因此，通過刪除這個(gè)特異性的增強(qiáng)子，減少BCL11A基因的表達(dá)，進(jìn)而增加HbF含量的方法，可以作為緩解β-globin疾病病情的新策略。
　　針對BCL11A基因的特異性增強(qiáng)子區(qū)域，在其兩側(cè)分別設(shè)計(jì)了一對gRNA，通過同時(shí)誘發(fā)此區(qū)域的的兩端發(fā)生雙鏈斷裂，達(dá)到刪除DNA片段的目的。將包含兩個(gè)gRNA的CRISPR/Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入HUDEP-2(Human Umbilical Cord

12、BloodDerived Erythoid Progenitor-2)細(xì)胞系，構(gòu)建純合型和雜合型細(xì)胞株，進(jìn)而檢驗(yàn)BCL11A與γ-globin的表達(dá)水平及它們之間的關(guān)系;此外，利用同樣的系統(tǒng)，在CD34+造血干細(xì)胞中進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞中的大片段基因刪除效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)胞系;增強(qiáng)子缺失的細(xì)胞株，純合型中γ-globin的表達(dá)水平在β類globin中的比例，從對照組的1％提高到45％，雜合子則提高到20％左右;造血干細(xì)胞中