CRISPR-Cas9高效等位基因編輯系統(tǒng)的構建及其在豬基因組編輯中的應用研究.pdf

1、基因組編輯是借助于細胞自身的DNA損傷修復機制對目標基因序列進行堿基刪除、插入或突變的基因組操作過程。早期僅依靠自發(fā)性同源重組的基因組編輯效率極低，直到人工核酸酶出現(xiàn)，由人工核酸酶定點切割DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂，激活體內DNA修復機制進行定點的基因組編輯，極大的提高了編輯的效率。隨著測序技術的不斷發(fā)展，一些基因得到注釋，基因功能的研究成為重點和熱點，目前研究基因功能的手段主要是基因修飾技術。近年來，CRISPR/Cas9核酸酶以其簡單、快捷

2、、高效的特點迅速發(fā)展，廣泛運用于不同種類細胞的基因組修飾。精準的定點基因組編輯技術不僅能推進基因功能的研究，用于構建人類疾病模型、基因治療，還能加快動物的遺傳改良。
　　雙等位基因基因組修飾細胞的獲得費時、費力且效率很低，目前這仍然是基因組編輯技術中的一個難點。本研究開發(fā)了一套CRISPR/Cas9高效等位基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)有效整合了基因編輯陽性細胞富集報告系統(tǒng)（Surrogate Reporter,Rep）與含有sgRNA的供

3、體系統(tǒng)(Donor,Don)。其特點是既能作為供體提供修復的模板，又能作為報告系統(tǒng)反應核酸酶的活性和靶位點整合的效率。首先在哺乳動物細胞中對該系統(tǒng)(Rep/Don)進行了概念驗證，結果顯示雙等位基因位點的基因敲入效率得到了顯著提高。隨后用Rep/Don打靶系統(tǒng)在豬PK15細胞上對lnc-sscg3623基因進行了基因編輯研究，同樣獲得了高效雙等位基因位點的編輯結果。
　　1.構建用于哺乳動物細胞基因組編輯的三個整合系統(tǒng)Rep/Do

4、n PG、Rep/Don NR和Rep/Don ZR。其中Rep/Don PG系統(tǒng)中包含一個抗性基因(puror)和一個熒光蛋白基因(eGFP)，兩個基因通過剪切肽(T2A)連接（Puror-eGFP）。與前述整合系統(tǒng)類似，Rep/DonNR和Rep/Don ZR系統(tǒng)中分別含有Neor-mRFP和Zeor-mRFP元件。三個整合系統(tǒng)中每個抗性基因編碼區(qū)分別插入了CRISPR/Cas9的靶位點序列，該靶位點序列的兩端含有200bp的抗性基

5、因重復片段，從而構成了SSA(Single Strand Annealing)結構，當CRISPR/Cas9核酸酶對靶序列進行切割后，產(chǎn)生載體DNA的雙鏈斷裂，誘導細胞內DNA損傷修復機制的激活。從而對載體進行SSA介導的損傷修復，修復的結果導致抗性基因的閱讀框恢復正常表達。除了對整合系統(tǒng)中的報告基因進行靶向切割外，CRISPR/Cas9同時對細胞基因組上的靶位點進行切割，由于整合載體中含有基因組上靶位點的同源序列，細胞對基因組DNA的

6、損傷將會通過同源重組(Homologous Directed Repair,HDR)修復機制以載體為模板進行修復，通過對修復后的抗性基因篩選，能夠實現(xiàn)對基因組編輯后的陽性細胞富集。由于兩個等位基因位點上整合了含有不同抗性基因的供體，因此同時對兩個抗性基因的篩選能夠實現(xiàn)對雙等位基因位點編輯細胞的富集。
　　2.將構建的Rep/Don PG和Rep/Don ZR打靶系統(tǒng)在HEK293T細胞上對目標基因CCR5進行了編輯，結果表明，Re

7、p/Don PG和Rep/Don ZR單系統(tǒng)的雙敲效率分別是2.33％和2.08％，Rep/Don PG+ZR的雙敲效率為34.09％。
　　3.通過藥物殺傷實驗確定嘌呤霉素（Puromycin）、G418和博萊霉素(Zeocin)這三種抗生素藥物在豬PK15細胞中的最佳工作濃度。嘌呤霉素的最佳篩選濃度是1μg/mL，G418是1200μg/mL，博萊霉素為400μg/mL。
　　4.設計三條豬lncRNA基因lnc-ssc

8、g3623的sgRNA，構建了相應的CRISPR/Cas9表達載體和RPG報告載體，共轉染HEK293T細胞后通過綠色熒光蛋白報告基因的表達，初步判別sgRNA的效率，選擇了活性較高的sgRNA Tar2和sgRNA Tar1用于后續(xù)實驗。
　　5.構建了用于編輯豬lnc-sscg3623基因兩個靶位點Tar2和Tar1的Rep/Don PG、Rep/Don NR和Rep/Don ZR打靶系統(tǒng)及對應的CRISPR/Cas9打靶載體

9、。在lnc-sscg3623基因Tar1位點，Rep/Don PG、Rep/Don NR和Rep/Don ZR單個打靶系統(tǒng)在豬PK15細胞系中的單敲效率分別為:25％、37.5％和26.32％。Rep/Don PG+ZR的雙敲效率為:10％。在Tar2位點，經(jīng)過各打靶系統(tǒng)對應的抗生素（嘌呤霉素、G418和博萊霉素）篩選后，得到敲入的陽性細胞，三個單系統(tǒng)Rep/Don PG、Rep/Don NR、Rep/Don ZR的單敲效率分別為:75