布魯氏菌中CRISPr-Cas9基因編輯技術(shù)研究.pdf

1、布魯氏菌病是由革蘭氏陰性菌布魯氏菌引起的人畜共患慢性傳染病，主要引起家畜流產(chǎn)、睪丸炎，人感染后會出現(xiàn)波浪熱、關(guān)節(jié)炎，慢性患者會喪失勞動能力，給畜牧業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失也極大地危害著人類的健康。目前，沒有安全可靠的人用布病疫苗，畜用布病疫苗使用最廣泛的是弱毒活疫苗，但普遍存在毒力強、免疫時效短、易感染孕畜、干擾血清學(xué)免疫診斷等問題。布魯氏菌的胞內(nèi)生存機制以及致病機制還不清楚，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，依靠其毒力基因完成其胞內(nèi)生存與繁殖機制。隨著分子

2、生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，布魯氏菌毒力基因缺失疫苗有望成為控制布病疫情的新型安全有效的基因疫苗，成為了當(dāng)下布病疫苗的研究熱點。目前，布魯氏菌基因缺失疫苗都是采用傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)對布魯氏菌的毒力基因進行缺失，但是由于同源重組技術(shù)自身的局限性，限制了其在實驗研究中的發(fā)展。
　　近年來，一種新型、高效的基因編輯技術(shù)，CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠進行精確高效的基因敲除或者修飾，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物等真核生物以及部分原核生物如大腸桿菌、根瘤農(nóng)桿

3、菌等細菌的基因編輯。到目前為止，該基因編輯系統(tǒng)還沒有在布魯氏菌中進行基因編輯的報道。本研究的目的是探究CRISPR-Cas9技術(shù)在布魯氏菌中進行基因編輯的應(yīng)用情況，為布魯氏菌基因功能研究提供平臺，也為開拓更高效、便捷的布魯氏菌毒力基因編輯技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。
　　在本研究中，我們首先驗證了表達CRISPR-Cas9系統(tǒng)基本元件（pBBR1復(fù)制子、pcat啟動子）在布魯氏菌中是否能夠正常表達。通過構(gòu)建載體質(zhì)粒驗證了泛宿主pBBR1復(fù)制

4、子及pcat啟動子在布魯氏菌中可以正常發(fā)揮作用。之后，我們將CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建于載體質(zhì)粒中，驗證了Cas9蛋白在布魯氏菌中可以正常表達，并且可以切割布魯氏菌基因組使布魯氏菌致死。由于布魯氏菌中缺乏非同源末端連接修復(fù)機制，因此將同源修復(fù)序列亞克隆至CRISPR-Cas9表達載體中，同時，為了克服質(zhì)粒殘留帶來的鑒定干擾問題，以及防止DNA污染以及抗性基因引入帶來的生物安全問題，將自殺基因sacB基因亞克隆至CRISPR-Cas9

5、表達載體中，至此，基因敲除同源修復(fù)自殺質(zhì)粒構(gòu)建完成，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至布魯氏菌感受態(tài)中，利用10％蔗糖進行質(zhì)粒消除后，利用PCR技術(shù)、測序鑒定待檢缺失株都為假陽性，都為‘escapers’。
　　1、以質(zhì)粒pBBR1MCS-5為載體骨架，以pBBR1為復(fù)制子，以質(zhì)粒pZK001-szk001為模板克隆pcat啟動子、rmB T1 terminator、大腸桿菌ColE1復(fù)制子，以質(zhì)粒pET28a為模板克隆lacI基因，構(gòu)建誘導(dǎo)型穿梭載

6、體質(zhì)粒。以pXG-10sf質(zhì)粒為模板克隆lacZ&gfP基因，利用酶切酶連方法連接到載體上，以gfP為報告基因檢測誘導(dǎo)型pcat啟動子在布魯氏菌中的表達情況。
　　2、以質(zhì)粒pZK35為模板克隆cas9基因的CDS以及sgRNA骨架，利用酶切酶連技術(shù)將CRISPR-Cas9元件連接至載體質(zhì)粒中，以布魯氏菌國際標(biāo)準株16M基因組為模板，利用生物學(xué)軟件設(shè)計布魯氏菌hfq基因的sgRNA dimer，利用酶切酶連方法連接至誘導(dǎo)型表達CR

7、ISPR-Cas9質(zhì)粒上，分別將表達CRISPR-Cas9-sgRNA(targeting hfq)質(zhì)粒、CRISPR-Cas9-sgRNA(nonspecific)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至16M布魯氏菌感受態(tài)細胞中，檢測CRISPR-Cas9在布魯氏菌中能否發(fā)揮有效的基因編輯功能。Western blot結(jié)果顯示Cas9蛋白在布魯氏菌中能夠正常表達，轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示Cas9蛋白能夠切割布魯氏菌基因組。
　　3、以質(zhì)粒pK18mobSacB為模板克

8、隆sacB基因，然后以布魯氏菌國際標(biāo)準株16M基因組模板克隆靶基因hfq的上下游同源臂，分別利用酶切酶連、Infusion技術(shù)將靶基因的同源修復(fù)序列、sacB基因，構(gòu)建至誘導(dǎo)型CRISPR-Cas9表達載體中，構(gòu)建完整的基因敲除同源修復(fù)自殺質(zhì)粒。利用電轉(zhuǎn)化方法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入布魯氏菌16M布魯氏菌感受態(tài)細胞，利用終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)CRISPR-Cas9的表達進行靶基因的切割，最后利用終濃度為10％蔗糖將質(zhì)粒消除。利用PC