一種新型的細菌體內(nèi)CRISPR-Cas9檢測系統(tǒng)的建立及其活性鑒定.pdf

1、目的：
　　CRISPR/Cas9是一種新型的基因編輯技術(shù)，其操作簡單、可對基因組特定位點進行切割，但存在一定的脫靶性，有待深入探討。本論文通過建立一種不受序列限制且酶切連接反應(yīng)一步進行的分子克隆方法，構(gòu)建Cas9蛋白在大腸埃希菌和恥垢分枝桿菌中的表達質(zhì)粒，同時構(gòu)建在恥垢分枝桿菌中表達結(jié)核分枝桿菌ClpC2蛋白和mCherry熒光蛋白的質(zhì)粒；在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建一種在細菌體內(nèi)通過同源重組和具有同源臂的熒光報告基因mCherry對Cas

2、9蛋白及不同的guide RNA設(shè)計對靶標序列的切割效率、脫靶效應(yīng)等的檢測系統(tǒng)。為后續(xù)深入研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)、guide RNA的設(shè)計及其生物學應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.設(shè)計含有甲基化位點的引物，PCR目的基因和載體。將擴增得到的片段進行純化，目的片段與載體PCR產(chǎn)物取相同摩爾數(shù)混合；利用識別甲基化C的 FspEⅠ內(nèi)切酶，向混合均勻的PCR產(chǎn)物中加入T4 DNA連接酶、FspEⅠ內(nèi)切酶、a

3、ctivator、FspEⅠ內(nèi)切酶buffer，以及ATP混勻，快速構(gòu)建重組質(zhì)粒pTac-Cas9、pMV261-Cas9、pMV261-ClpC2及 pMV261-mCherry。分別將重組質(zhì)粒 pTac-Cas9轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α；pMV261-Cas9、pMV261-ClpC2以及pMV261-mCherry轉(zhuǎn)化至恥垢分枝桿菌，利用Western-blot檢測其蛋白的表達活性。
　　2.通過在熒光報告基因mCherr

4、y的ORF中插入了guide RNA的靶標序列，并在靶標序列的兩側(cè)預(yù)留了不同長度的上下游同源編碼區(qū),利用Cas9蛋白切割，被隔開的mCherry基因通過同源重組的方式進行自我修復(fù)，用肉眼直接觀察是否出現(xiàn)紅色菌落判斷其修復(fù)功能。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計了與靶標序列互補長度不同的guide RNA以及向guide RNA添加與靶標序列不配對的堿基進行切割實驗，利用抗性平板篩選，最后通過紅色菌落進行計數(shù)，用SPSS軟件進行分析。
　　結(jié)果：

5、r>　　1.利用FspEⅠ內(nèi)切酶和T4連接酶一步反應(yīng)的分子克隆方法，成功構(gòu)建了在大腸埃希菌DH5α的表達質(zhì)粒pTac-Cas9，測序鑒定正確, Western-blot檢測結(jié)果顯示Cas9蛋白在DH5α中表達成功；此外，利用該技術(shù)構(gòu)建了可在分枝桿菌中表達的質(zhì)粒 pMV261-Cas9、pMV261-ClpC2及pMV261-mCherry，并在恥垢分枝桿菌中成功表達ClpC2和mCherry蛋白，但pMV261-Cas9轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌

6、不成功，原因有待進一步研究。
　　2.通過在熒光報告基因mCherry的ORF中插入了guide RNA的靶標序列，并在靶標序列的兩側(cè)預(yù)留了不同長度的上下游同源編碼區(qū)，通過Cas9蛋白切割實驗發(fā)現(xiàn)，沒有同源區(qū)域的質(zhì)粒被切割后無紅色菌落。而包含42bp、78bp、136bp同源區(qū)的質(zhì)粒被Cas9切割后可以有效重組，經(jīng)過紅色菌落計數(shù)，發(fā)現(xiàn)具有相似的重組效率；與靶標序列互補長度不同的guide RNA，結(jié)果顯示配對區(qū)域為19bp具有最高

7、的切割效率，20bp次之，其他長度效率依次降低；向guide RNA添加與靶標序列不配對的堿基進行切割實驗，發(fā)現(xiàn)guide RNA相比靶標序列突變的堿基位置位于倒數(shù)第二位或第六位（5′-3′）仍能被Cas9切割，出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了一種不受序列限制、酶切連接反應(yīng)一步進行的分子克隆方法，構(gòu)建了在大腸埃希菌DH5α中的表達質(zhì)粒pTac-Cas9、分枝桿菌中的表達質(zhì)粒pMV261-Cas9、pMV261-