基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的SND1基因敲除HeLa細(xì)胞穩(wěn)定株的制備與鑒定.pdf

1、研究目的：SND1，又稱為p100蛋白或Tudor-SN蛋白。最初研究發(fā)現(xiàn)其是EB病毒細(xì)胞核抗原2(Epstein-Barr virus nuclear protein2)的共活化因子。該蛋白在各物種中分布廣泛，在不同生物中具有高度的保守性，參與調(diào)控細(xì)胞的多種重要生理過程。SND1蛋白具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和剪接加工pre-mRNA的能力，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但到目前為止，SND1蛋白參與上述腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制還不清楚，

2、有待于進(jìn)一步研究。傳統(tǒng)的利用 siRNA干擾基因表達(dá)研究基因的方法不能在細(xì)胞中完全敲除 SND1基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，導(dǎo)致 SND1蛋白不能完全從細(xì)胞中去除，影響對(duì)其功能的研究。最新的第三代基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cas9技術(shù)利用序列特異性的向?qū)NA分子引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9對(duì)目標(biāo)靶點(diǎn)的特異性結(jié)合與識(shí)別，并利用其活性中心對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割，從而完成對(duì)基因組的修飾與編輯。但傳統(tǒng)的 CRISPR/Cas9技術(shù)也存在脫靶效應(yīng)。而改良的 CRI

3、SRP/Cas9基因編輯系統(tǒng)的 Cas9蛋白可以被改造成為特異性的切口酶，只在特定的DNA位點(diǎn)造成單鏈切口，從而激活細(xì)胞內(nèi)的同源重組(HR)機(jī)制，而又可以避免引起非同源末端連接(NHEJ)造成的基因突變，從而極大提高基因編輯的效率和精確性。因此我們利用最新的改良后的 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞中完全敲除SND1基因，同時(shí)又可以避免傳統(tǒng)方法導(dǎo)致的嚴(yán)重脫靶效應(yīng)。從而構(gòu)建HeLa細(xì)胞SND1基因敲除穩(wěn)定株，為后續(xù)

4、進(jìn)一步研究敲除SND1的HeLa細(xì)胞對(duì)5-Fu化療藥物敏感性的影響以及對(duì)細(xì)胞周期的影響奠定基礎(chǔ)。
　　方法：由于人的 SND1基因第一個(gè)外顯子區(qū)和基因編碼區(qū)的重疊區(qū)域過短，不利于設(shè)計(jì)特異性的sgRNA。因此選取第二個(gè)外顯子區(qū)進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì)。利用生物信息學(xué)手段設(shè)計(jì)一對(duì)特異性識(shí)別SND1基因第二個(gè)啟動(dòng)子的上下游sgRNA，以包含CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)必需元件的PX462質(zhì)粒為載體，構(gòu)建出一對(duì)靶向SND1基因第二啟動(dòng)子的上下

5、游序列的CRISPR/Cas9重組真核表達(dá)質(zhì)粒。酶切和測(cè)序鑒定序列正確后，通過轉(zhuǎn)染試劑將這一對(duì)重組質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入HeLa細(xì)胞中，24h后使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，存活下來的為陽性細(xì)胞，然后通過有限稀釋培養(yǎng)的方法的篩選出陽性的單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。最后用Western Blot鑒定敲除SND1基因的單克隆細(xì)胞。隨后，我們進(jìn)一步利用免疫熒光法確認(rèn)在HeLa細(xì)胞中完全敲除了SND1基因；利用CCK-8法進(jìn)一步研究了敲除SND1基因的HeLa細(xì)

6、胞對(duì)5-Fu藥物敏感度的影響，利用流式細(xì)胞術(shù)研究了敲除SND1基因?qū)eLa細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果：我們通過酶切和測(cè)序的方法驗(yàn)證了設(shè)計(jì)的 sgRNA正確插入到表達(dá)CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)的PX462質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后用嘌呤霉素篩選陽性單克隆細(xì)胞，提取蛋白利用Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沒有SND1蛋白的表達(dá)；同時(shí)利用免疫熒光法檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)完全敲除了 HeLa細(xì)胞的 SND1的表達(dá)。我們利用CCK-8法檢測(cè)了敲

7、除SND1蛋白的HeLa細(xì)胞對(duì)5-Fu敏感性的影響，結(jié)果表明當(dāng)敲除細(xì)胞內(nèi)的SND1基因表達(dá)后，HeLa細(xì)胞對(duì)于5-Fu化療藥物敏感度增加，提示細(xì)胞內(nèi) SND1可能參與腫瘤細(xì)胞化療耐藥的產(chǎn)生。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)敲除HeLa細(xì)胞的SND1基因后，處于G1期細(xì)胞比例明顯增多，G2和S期細(xì)胞比例明顯降低，說明HeLa細(xì)胞敲除SND1基因后細(xì)胞周期被抑制。
　　結(jié)論：我們成功利用改良后的 CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)構(gòu)建出 HeLa細(xì)胞