應(yīng)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)生產(chǎn)NRAMP1基因精準(zhǔn)插入的轉(zhuǎn)基因牛.pdf

1、結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌感染造成的人畜共患病，全球范圍內(nèi)潛在感染人口多達(dá)20億，其中約5-10％的攜帶者會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀，每年可造成約150萬死亡病例。牛結(jié)核病由牛型結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium bovis，M.bovis）感染造成，同時(shí)可經(jīng)由直接接觸患病動(dòng)物或未消毒的乳肉制品引起人類患病。由于野生宿主廣泛存在、畜牧產(chǎn)品交易全球化和高效疫苗缺失，M.bovis感染造成的牛結(jié)核病至今在非洲、拉丁美洲和亞洲等地區(qū)依然未能被有效控

2、制，對(duì)人類健康和農(nóng)業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重影響。研究者普遍認(rèn)為宿主對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的抵抗力與多種遺傳因素相關(guān)，其中多項(xiàng)研究表明NRAMP1基因在機(jī)體中的表達(dá)水平與結(jié)核桿菌的抵抗力間存在依賴關(guān)系。本研究的前期工作同樣證明了提高NRAMP1基因的表達(dá)量可以有效增強(qiáng)宿主細(xì)胞的抗結(jié)核能力。因而，本研究旨在通過轉(zhuǎn)基因方法提高NRAMP1基因的表達(dá)量，培育出抗結(jié)核的轉(zhuǎn)基因牛新品種。
　　作為當(dāng)前廣泛使用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)工具，CRISPR/Cas9系統(tǒng)

3、已被應(yīng)用于小鼠、豬、山羊及猴等物種。同時(shí)，多種針對(duì)于Cas9蛋白本身的突變及相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因策略已經(jīng)被提出以減少目前最廣泛關(guān)注的脫靶效應(yīng)問題，并取得了矚目成績。然而關(guān)于哺乳動(dòng)物基因組上外源功能基因插入的報(bào)道非常有限，而驗(yàn)證這些打靶策略在轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)上的可行性，同樣具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究首次應(yīng)用單個(gè)Cas9缺口酶(Cas9n)來誘導(dǎo)功能基因插入并生產(chǎn)出了基因組范圍內(nèi)脫靶效應(yīng)減弱的轉(zhuǎn)基因牛。進(jìn)一步的體外與體內(nèi)攻菌實(shí)驗(yàn)表明NRAMP1基因可以

4、通過增加表達(dá)量激活巨噬細(xì)胞凋亡通路，限制胞內(nèi)M.bovis的增殖進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因牛的結(jié)核病抗性。本研究主要內(nèi)容如下:
　　1.在?；蚪M上選擇了25號(hào)染色體上FSCN1基因和ACTB基因間區(qū)域作為打靶基因座。應(yīng)用CRISPR/Cas9設(shè)計(jì)軟件ZiFiT與Cas-OFFinder，初步篩選出全基因組范圍內(nèi)潛在脫靶位點(diǎn)最少的sgRNA序列。構(gòu)建基因打靶載體，在BFFs上應(yīng)用Surveyor錯(cuò)配核酸酶檢測野生型Cas9核酸酶在各基因打靶位

5、點(diǎn)的切割效率。進(jìn)一步設(shè)計(jì)供體載體，比較野生型Cas9核酸酶、成對(duì)Cas9切口酶、單一Cas9切口酶等不同打靶策略在相應(yīng)打靶位點(diǎn)的切割效率與外源基因整合效率。
　　2.應(yīng)用沒有核酸酶活性的dCas9在BFFs上進(jìn)行ChIP-seq實(shí)驗(yàn)，鑒定各打靶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的dCas9∶sgRNA復(fù)合物在?；蚪M上的主要識(shí)別與結(jié)合位點(diǎn)。通過分析CRISPR/Cas9系統(tǒng)在?；蚪M上的主要結(jié)合特點(diǎn)與影響因素，獲取了各打靶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的潛在脫靶位點(diǎn)信息，建立了

6、轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)中脫靶效應(yīng)的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。
　　3.構(gòu)建針對(duì)45號(hào)位點(diǎn)的Cas9核酸酶與Cas9切口酶基因打靶載體及對(duì)應(yīng)供體載體pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro-1/2，共轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞后應(yīng)用嘌呤霉素篩選出外源基因穩(wěn)定整合的克隆。通過junction PCR、Sanger測序、Southern blot和絕對(duì)定量鑒定出NRAMP1基因定點(diǎn)整合的陽性克隆。進(jìn)一步以陽性細(xì)胞為供核細(xì)胞，進(jìn)行體細(xì)胞核移植與胚胎移植操作，最終獲得了

7、11頭NRAMP1轉(zhuǎn)基因奶牛。
　　4.針對(duì)轉(zhuǎn)基因牛進(jìn)行體外結(jié)核分枝桿菌攻菌實(shí)驗(yàn)，Western blot、流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測和CFU計(jì)數(shù)結(jié)果表明攻菌后NRAMP1基因可以通過增加表達(dá)量激活巨噬細(xì)胞凋亡通路，限制胞內(nèi)M.bovis的增殖。進(jìn)一步對(duì)NRA MP1轉(zhuǎn)基因牛進(jìn)行體內(nèi)攻菌實(shí)驗(yàn)，IFN-γ釋放水平檢測和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)證明NRAMP1轉(zhuǎn)基因?？梢杂行У挚菇Y(jié)核分枝桿菌感染，具備增強(qiáng)的抗結(jié)核能力。
　　綜上所述，本研究應(yīng)用