腺病毒介導(dǎo)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)和BioID在研究體內(nèi)蛋白相互作用中的應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)的相互作用是蛋白質(zhì)執(zhí)行其生物學功能的分子基礎(chǔ)，研究蛋白質(zhì)的相互作用，可以提高我們對代謝調(diào)控和生理過程的認識和理解。目前所采用的研究蛋白相互作用的方法包括酵母雙雜交，GST pulldown和免疫共沉淀。然而，這些方法存在較高的假陽性，以及一些內(nèi)在的相互作用不能被檢測到的問題。因此，在現(xiàn)有研究條件下，我們利用腺病毒介導(dǎo)的 CRISPR/Cas9系統(tǒng)，結(jié)合最近新發(fā)展的研究蛋白相互作用的方法BioID，設(shè)計出一套在生理條件下研究蛋白相互

2、作用的方法。簡單來說，首先我們通過腺病毒介導(dǎo)的 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對靶基因進行特異切割，造成雙鏈斷裂，觸發(fā)細胞的同源修復(fù)機制，此時提供同源修復(fù)模板，模板左右各有1kb左右的同源區(qū)域，中間是BioID技術(shù)中核心分子BirA*基因，導(dǎo)致BirA*在同源修復(fù)機制下，定向敲入目的基因，從而構(gòu)成融合基因，進而表達融合蛋白。BirA*可以生物素化目標蛋白附近的蛋白包括相互作用蛋白，通過親和富集，借助生物質(zhì)普的高分辨率和高靈敏度，從而鑒定出這