CRISPR-CAS9技術(shù)介導(dǎo)的人胰島素(hINS)在牛成纖維細(xì)胞中定點(diǎn)整合的研究.pdf

1、動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器是利用乳腺特異性調(diào)控元件驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)，從而在乳汁中獲得有價(jià)值的重組蛋白的基因工程技術(shù)。在目前普遍使用的基因編輯技術(shù)中，CRISPR/Cas9技術(shù)因其靶向性強(qiáng)、剪切效率高，在基因定點(diǎn)敲除和敲入方面顯示出極大優(yōu)勢。本文利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源打靶技術(shù)，對乳腺特異性表達(dá)人胰島素的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備進(jìn)行了初步研究。
　　本研究選擇以牛β-casein第二外顯子為外源基因插入位點(diǎn)，新霉素抗性基因neo表達(dá)框架P

2、Ⅲ-EGFP-PGK-Neo質(zhì)粒為骨架，通過PCR分別擴(kuò)增奶牛β-casein第二外顯子5'同源臂CNS2LA、3'同源臂CNS2RA，hINS基因，負(fù)篩選基因DTA和bGH PolyA序列，并按順序與質(zhì)粒PⅢ-EGFP-PGK-Neo連接，最終構(gòu)建全長9kb，以DTA為負(fù)篩選標(biāo)記，CNS2LA和CNS2RA為同源臂，hINS為目的基因，bGH PolyA序列為轉(zhuǎn)錄終止信號的乳腺組織特異性表達(dá)人胰島素的同源打靶載體;同時(shí)在牛β-case

3、in第二外顯子設(shè)計(jì)3對sgRNA序列，構(gòu)建CRISPR/Cas9定點(diǎn)切割載體。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列測序表明，同源打靶載體和CRISPR/Cas9切割載體構(gòu)建成功。通過脂質(zhì)體法將同源打靶載體和CRISPR/Cas9定點(diǎn)切割載體共轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選獲得單克隆細(xì)胞，利用PCR擴(kuò)增和DNA測序鑒定，篩選出6株發(fā)生同源重組的單克隆細(xì)胞。
　　為驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后hINS基因的表達(dá)，本研究利用脂質(zhì)體法將同源打靶載體轉(zhuǎn)染牛胎兒