Noggin定點(diǎn)整合打靶載體的構(gòu)建及其體外轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:為研究小鼠Noggin基因的功能和作用，我們擬克隆小鼠Noggin基因，構(gòu)建了定點(diǎn)整合型毛囊特異性表達(dá)載體pDs-MSKTLNE，進(jìn)而對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)和小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，之后通過G418和GANC共同篩選以獲得穩(wěn)定表達(dá)Noggin基因定點(diǎn)整合的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆，驗(yàn)證pDs-MSKTLNE構(gòu)建的合理性。本研究結(jié)果為Noggin基因的功能研究提供了前期基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)目的在于探討小鼠1

2、1號(hào)染色體的角蛋白16與角蛋白14之間的這段區(qū)間是否可以作為高等生物的另一個(gè)打靶位點(diǎn)。
　　1.小鼠Noggin基因定點(diǎn)整合型載體的構(gòu)建
　　構(gòu)建一套用于小鼠Noggin基因定點(diǎn)整合的置換型打靶載體pDs-MSKTLNE，為定點(diǎn)整合的同源重組打靶載體，載體部分包含5.0kb左右的同源長臂和4.0kb左右的同源短臂，人源性K14啟動(dòng)子，由它啟動(dòng)的目的基因Noggin，以及作為正篩選標(biāo)記的Neor基因，和負(fù)篩選標(biāo)記HSV-TK基

3、因。首先克隆獲得這些片段，然后依次將這些片段按同源短臂，HSV-TK，同源長臂，人源性K14啟動(dòng)子，以及目的基因Noggin的順序連接至載體骨架上。
　　2.Noggin基因定點(diǎn)整合小鼠成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞的制備
　　利用AgeI線性化打靶載體pDs-MSKTLNE，按照脂質(zhì)體試劑盒操作說明，700ug的線性化質(zhì)粒+2ul脂質(zhì)體，共同孵育30分鐘，轉(zhuǎn)染事先饑餓處理的胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)，經(jīng)G418和GANC篩選15天，一

4、共得到了103個(gè)抗性克隆，通過PCR鑒定，沒有得到發(fā)生同源重組的陽性克隆。其中，成纖維細(xì)胞隨機(jī)整合效率為23.3％(24/103)。利用線性化打靶載體pDs-MSKTLNE利用AgeI線性化打靶載體pDs-MSKTLNE，用脂質(zhì)體試劑盒操作說明，1000ug的線性化質(zhì)粒+2ul脂質(zhì)體，共同孵育30分鐘，轉(zhuǎn)染事前饑餓處理的轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)，經(jīng)G418和GANC篩選，一共得到了124個(gè)G418抗性克隆，經(jīng)PCR鑒定，通過PCR