不同濃度葡萄糖對(duì)體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞功能的影響.pdf

1、研究背景： 在外科危重病人中常常遇到高血糖，很大的因素是應(yīng)激性高血糖以及許多糖尿病病人，血糖持續(xù)升高可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一系列的不良反應(yīng)，增加機(jī)體高滲性昏迷、糖尿病酮癥酸中毒發(fā)生的可能性，嚴(yán)重危及生命。高血糖的發(fā)生提示機(jī)體處于代謝紊亂狀態(tài)，其持續(xù)存在更增加了感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此如何應(yīng)對(duì)創(chuàng)傷伴隨高血糖并發(fā)癥的出現(xiàn)，一直是創(chuàng)傷外科亟待解決的問題。創(chuàng)面損傷修復(fù)時(shí)，創(chuàng)傷組織的高糖環(huán)境對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)有著很大影響，使得創(chuàng)面愈合這一過程變得更為復(fù)雜。

2、 創(chuàng)傷愈合是一個(gè)復(fù)雜而有序的生物學(xué)過程，涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、遷移，創(chuàng)面重塑等多個(gè)序貫又相互交叉的病理生理過程。研究已發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞（fibroblast）在此修復(fù)過程中起著十分重要的作用。長(zhǎng)期以來(lái)它也一直被視為是肉芽組織收縮的能量供應(yīng)者，對(duì)傷口有效而迅速的關(guān)閉起著重要的作用。爾后提出了肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞的概念，肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是由創(chuàng)口周圍的皮膚、皮下組織中的成纖維細(xì)胞在各種刺激因子的作用下轉(zhuǎn)變而來(lái)，其分泌的肌動(dòng)蛋白（α—sm

3、ooth muscle actin，α—SMA）被普遍認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞表型的可靠證據(jù)。 創(chuàng)傷后引起的高血糖對(duì)于創(chuàng)面愈合有著十分重要的影響，普遍認(rèn)為高血糖會(huì)影響創(chuàng)面的愈合，然而卻沒有關(guān)于高糖環(huán)境對(duì)于成纖維細(xì)胞生物功能影響的細(xì)胞分子生物學(xué)研究以及成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞在高糖環(huán)境下的關(guān)系的研究。 本實(shí)驗(yàn)即是利用體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞，在體外模擬高血糖的環(huán)境，設(shè)定不同糖濃度，探討不同時(shí)間下成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況和膠原合成

4、情況以及其和肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞之間的關(guān)系，進(jìn)行基礎(chǔ)性研究。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1．體外培養(yǎng)和鑒定小鼠皮膚成纖維細(xì)胞。 2．研究不同糖濃度和時(shí)間下成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況和膠原合成情況。 3．研究不同糖濃度培養(yǎng)液條件下成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的情況 實(shí)驗(yàn)方法： 將昆明小鼠斷頸處死后，在其背部用備皮刀將毛刮凈后酒精消毒，取1cm×1cm大小的皮膚，用消毒剪剪下皮膚后，用生理鹽水洗凈，剪碎后用1％膠原

5、酶溶液37℃水浴下作用10分鐘，然后用100目的金屬網(wǎng)篩過濾，取過濾液用試管1000轉(zhuǎn)/分下離心，棄上清，用10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液（糖濃度為25mmol/L）將沉淀溶解，并放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，成纖維細(xì)胞約3小時(shí)后即可貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞貼壁后即刻棄上清，用10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后傳代數(shù)次，純化后得到小鼠皮膚成纖維細(xì)胞。在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入一定量的左旋葡萄糖，配成配置成糖濃度梯度為25，40，55，

6、70，85 mmol/L的培養(yǎng)液，其滲透壓計(jì)算后分別為（5311 mmHg，5603 mmHg，5896 mmHg，6181 mmHg，6474 mmHg），在正常值511～6227 mmHg范圍內(nèi)或稍高。依次為A，B，C，D，E五個(gè)糖濃度組，分別進(jìn)行成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，利用爬片法進(jìn)行細(xì)胞免疫組織化學(xué)法鑒定成纖維細(xì)胞；然后使用CCK—8方法測(cè)定不同糖濃度培養(yǎng)液培養(yǎng)12h、24h和48h成纖維細(xì)胞增殖情況，用Elisa方法測(cè)定不同糖濃度培養(yǎng)

7、液培養(yǎng)12h、24h和48h成纖維細(xì)胞分泌I型膠原的情況；最后用Western—blot方法測(cè)定不同濃度培養(yǎng)液培養(yǎng)12h、24h和48h后成纖維細(xì)胞肌動(dòng)蛋白（α—SMA）的含量。 結(jié)果： 1．成纖維細(xì)胞免疫組織化學(xué)法鑒定含有Ⅰ型膠原的成纖維細(xì)胞被染成棕色，細(xì)胞成多邊形和長(zhǎng)梭形，細(xì)胞較大，且鏡下幾乎均為染色的細(xì)胞；證實(shí)原代培養(yǎng)的細(xì)胞中成纖維細(xì)胞為主，且純度較高，細(xì)胞間未觀察到有被染色的Ⅰ型膠原 2．利用CCK試劑盒

8、測(cè)定成纖維細(xì)胞的增殖，OD值和細(xì)胞數(shù)目成正比。結(jié)果如表1所示：（1）在相同培養(yǎng)時(shí)間條件下，隨著糖濃度的增加（大于40mmol/L），成纖維細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行性減少（P<0．01）：（2）在24，40mmol/L培養(yǎng)濃度下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，成纖維細(xì)胞的數(shù)目逐漸增加；（3）在55，70，85 mmol/L培養(yǎng)濃度下，成纖維細(xì)胞的數(shù)目無(wú)明顯變化。 3．利用Elisa試劑盒測(cè)定細(xì)胞外Ⅰ型膠原，結(jié)果顯示每組均可檢測(cè)到細(xì)胞外Ⅰ型膠原的存在，統(tǒng)

9、計(jì)結(jié)果顯示其每組的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型膠原在相同時(shí)間不同培養(yǎng)濃度下的總量并無(wú)明顯差別（P>0．05）。 4．對(duì)細(xì)胞進(jìn)行既定處理后，對(duì)成纖維細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的表達(dá)做了半定量測(cè)定，隨著濃度的增加，成纖維細(xì)胞中表達(dá)肌動(dòng)蛋白的量是上升的。 結(jié)論： 1．利用膠原酶消化法原代分離和培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞的方法是可行的，并且可以得到純度較高的成纖維細(xì)胞。細(xì)胞免疫組織化學(xué)法鑒定成纖維細(xì)胞時(shí)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間Ⅰ型膠原纖維，Ⅰ型膠原纖維可以通過組織

10、液吹打的方法收集。 2．隨著細(xì)胞培養(yǎng)液糖濃度的升高，在糖濃度40mmol/L的范圍內(nèi)，隨著糖濃度升高，成纖維細(xì)胞的增殖不受影響，隨著糖濃度的進(jìn)一步升高，成纖維細(xì)胞的增殖速度明顯下降，高糖濃度可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖（P<0．01）。 3．隨著糖濃度的升高，成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原纖維的量并無(wú)太大變化（P>0．05），但是在相同培養(yǎng)時(shí)間條件下，隨著糖濃度的增加（大于40mmol/L），成纖維細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行性減少（P<0．01）