黃芩素對TGF-β1體外誘導肺成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的影響.pdf

1、目的:研究黃芩素(Baicalein,BAE)對TGF-β1體外誘導肺成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的影響，并初步探討其作用機制。
　　方法:體外培養(yǎng)人胚肺二倍體成纖維細胞WI-38，制備TGF-β1誘導肺成纖維細胞WI-38向肌成纖維細胞分化的細胞模型。采用MTT法檢測WI-38細胞的增殖率，Western Blot法檢測細胞內(nèi)α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型膠原蛋(Collage

2、nI,ColI)及相關(guān)蛋白表達的變化，光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)，免疫組化檢測細胞內(nèi)α-SMA蛋白表達。隨后在TGF-β1體外誘導肺成纖維細胞WI-38向肌成纖維細胞分化的細胞模型上，給予不同劑量的BAE干預，用MTT法檢測BAE對WI-38細胞的增殖的影響，免疫組化法觀察WI-38細胞內(nèi)α-SMA、Smad2蛋白的表達，透射電鏡觀察WI-38細胞中細胞器的結(jié)構(gòu)改變，掃描電鏡觀察WI-38細胞表面結(jié)構(gòu)改變。Westorn Blot檢測WI-

3、38細胞分化過程中相關(guān)蛋白α-SMA、ColI、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白的表達，以Reverse Transcription PCR法檢測BAE對TGF-β1體外誘導肺成纖維細胞WI-38細胞向肌成纖維細胞分化過程中α-SMA、ColI、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達的影響。
　　結(jié)果：MTT法檢測表明：與正常WI-38細胞組相比，5~40μg·L-1 TGF-β1作

4、用WI-38細胞4d后，細胞增殖率上升(P<0.05,P<0.01)，呈劑量依賴性；光學顯微鏡下可見：細胞增殖顯著，細胞形態(tài)改變，從較大的紡錘形或星形結(jié)構(gòu)的成纖維細胞分化為扁平狀纖維結(jié)構(gòu)的肌成纖維細胞，分化明顯；免疫組化熒光檢測顯示：正常WI-38細胞組α-SMA蛋白僅在細胞核內(nèi)表達，模型組α-SMA蛋白在細胞核與胞漿內(nèi)均表達；Western Blot結(jié)果：TGF-β1體外誘導4d后，WI-38細胞內(nèi)α-SMA、ColI蛋白的表達均上調(diào)

5、，這一結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致；與TGF/Smads信號通路相關(guān)的Smad2、Smad3蛋白表達均上調(diào)，并使其磷酸化(P<0.01,P<0.05)。由此表明在本實驗條件下，TGF-β1體外誘導WI-38成纖維細胞能分化為肌成纖維細胞的細胞模型，該作用可以維持3d。BAE干預下，光學顯微鏡觀察結(jié)果：TGF-β1誘導WI-38細胞分化過程中細胞增殖作用被明顯抑制；免疫組化顯示：α-SMA蛋白在WI-38細胞包漿內(nèi)表達減少，Smad2蛋白在WI

6、-38細胞核內(nèi)表達減少；透射電鏡觀察表明：WI-38細胞線粒體腫脹減少，髓鞘樣變改善；掃描電鏡觀察顯示：WI-38細胞表面微絨毛減少，褶皺較少出現(xiàn)；Western Blot結(jié)果：WI-38細胞中α-SMA、ColI蛋白的表達下調(diào)(P<0.01,P<0.05)，同時與TGF-β/Smads信號通路相關(guān)的Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3蛋白的表達下調(diào)(P<0.01,P<0.05)，而Smad7蛋白表達上調(diào)(P<0.05

7、)；RT-PCR結(jié)果：TGF-β1體外誘導WI-38細胞向肌成纖維細胞分化α-SMA、ColI、Smad2、Smad3 mRNA的表達下調(diào)(P<0.01,P<0.05)，Smad7 mRNA的表達上調(diào)(P<0.05)，由此提示BAE可抑制WI-38細胞分化。
　　結(jié)論：BAE對TGF-β1體外誘導肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的在分化過程有一定的抑制作用，該作用與抑制Smad2/3磷酸化及其細胞核轉(zhuǎn)位，上調(diào)Smad7，從而下調(diào)α-SM