microRNA-195對心肌成纖維細(xì)胞增殖及向成肌纖維細(xì)胞分化的調(diào)控作用.pdf

1、目的：觀察miR-195在心肌纖維化（cardiac fibrosis）中的預(yù)防性治療作用，并進(jìn)一步研究miR-195是否通過Chek1激活心肌成纖維細(xì)胞(CF)的增殖及向成肌纖維細(xì)胞(CMF)的分化，以探討miR-195在心肌纖維化中的作用機(jī)制。
　　方法：⑴提取心肌成纖維細(xì)胞:1.取1-3天新生SD大鼠心臟置于胰膠原酶溶液中反復(fù)消化，收集細(xì)胞差速貼壁3小時(shí)后獲得相對較純的心肌成纖維細(xì)胞，此為P0代，第二天將P0代1∶3傳代，此

2、為P1代，以后每4天傳代;2.應(yīng)用Real-timePCR、蛋白質(zhì)印跡法、免疫熒光檢測成肌纖維細(xì)胞特異表達(dá)蛋白α-SMA的表達(dá)量標(biāo)記分化。⑵MiR-195在心肌成纖維細(xì)胞增殖及分化中的作用機(jī)制:1.采用Real-time PCR檢測miR-195在P1、P2、P3代細(xì)胞中的表達(dá)量;2.MiR-195的激動劑agomir或抑制劑antagomir轉(zhuǎn)染P1代細(xì)胞，48小時(shí)后用Real-time PCR檢測miR-195的表達(dá)評價(jià)轉(zhuǎn)染效率，R

3、eal-time PCR、蛋白質(zhì)印跡法、免疫熒光檢測α-SMA的表達(dá)量，免疫熒光檢測EDU、Ki67的陽性率、蛋白質(zhì)印跡法檢測PCNA標(biāo)記細(xì)胞增殖，Real-time PCR檢測細(xì)胞周期基因Chek1、Cdc2a、Birc5、Nusap1、Spag5的表達(dá)量，蛋白質(zhì)印跡法檢測Chek1的表達(dá)量。⑶Chek1對心肌成纖維細(xì)胞增殖及分化的調(diào)控作用:用Chek1的干擾RNA-siRChek1轉(zhuǎn)染P1代細(xì)胞，72小時(shí)后Real-time PCR

4、檢測Chek1的表達(dá)量以評價(jià)干擾效率，Real-time PCR、免疫熒光檢測α-SMA的表達(dá)量，免疫熒光檢測EDU的陽性率。（四）計(jì)數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，各組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析， p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。全部數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用GraphPad Prism5做圖。
　　結(jié)果：①新生SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞分化:成肌纖維細(xì)胞的特異性表達(dá)蛋白α-SMA在

5、P2、P3代的表達(dá)量均高于P1代（p值均＜0.05）。②miR-195抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖及分化:1.MiR-195的表達(dá)量隨細(xì)胞傳代次數(shù)增加而升高，在P3代的表達(dá)量顯著升高（p值均＜0.05）;2.激動劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞后miR-195的表達(dá)量升高（p值均＜0.05），抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞后miR-195的表達(dá)下降（p值均＜0.05）;3.高表達(dá)miR-195后EDU、Ki67的陽性率及PCNA、α-SMA的表達(dá)量降低，降低miR-195后EDU

6、、Ki67的陽性率及PCNA、α-SMA的表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);4.MiR-195負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因Chek1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。③MiR-195通過Chek1調(diào)控心肌成纖維細(xì)胞的增殖及分化:1.SiRChek1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后Chek1的表達(dá)量明顯低于對照組（p值均＜0.05）。2.EDU的陽性率、α-SMA的表達(dá)量在siRChek1組、miR-195 antagomir與siRChek1共轉(zhuǎn)染組