microRNA-195對心肌成纖維細胞增殖及向成肌纖維細胞分化的調控作用.pdf

1、目的：觀察miR-195在心肌纖維化（cardiac fibrosis）中的預防性治療作用，并進一步研究miR-195是否通過Chek1激活心肌成纖維細胞(CF)的增殖及向成肌纖維細胞(CMF)的分化，以探討miR-195在心肌纖維化中的作用機制。
　　方法：⑴提取心肌成纖維細胞:1.取1-3天新生SD大鼠心臟置于胰膠原酶溶液中反復消化，收集細胞差速貼壁3小時后獲得相對較純的心肌成纖維細胞，此為P0代，第二天將P0代1∶3傳代，此

2、為P1代，以后每4天傳代;2.應用Real-timePCR、蛋白質印跡法、免疫熒光檢測成肌纖維細胞特異表達蛋白α-SMA的表達量標記分化。⑵MiR-195在心肌成纖維細胞增殖及分化中的作用機制:1.采用Real-time PCR檢測miR-195在P1、P2、P3代細胞中的表達量;2.MiR-195的激動劑agomir或抑制劑antagomir轉染P1代細胞，48小時后用Real-time PCR檢測miR-195的表達評價轉染效率，R

3、eal-time PCR、蛋白質印跡法、免疫熒光檢測α-SMA的表達量，免疫熒光檢測EDU、Ki67的陽性率、蛋白質印跡法檢測PCNA標記細胞增殖，Real-time PCR檢測細胞周期基因Chek1、Cdc2a、Birc5、Nusap1、Spag5的表達量，蛋白質印跡法檢測Chek1的表達量。⑶Chek1對心肌成纖維細胞增殖及分化的調控作用:用Chek1的干擾RNA-siRChek1轉染P1代細胞，72小時后Real-time PCR

4、檢測Chek1的表達量以評價干擾效率，Real-time PCR、免疫熒光檢測α-SMA的表達量，免疫熒光檢測EDU的陽性率。（四）計數(shù)資料采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，各組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析， p＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。全部數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，用GraphPad Prism5做圖。
　　結果：①新生SD大鼠心肌成纖維細胞向成肌纖維細胞分化:成肌纖維細胞的特異性表達蛋白α-SMA在

5、P2、P3代的表達量均高于P1代（p值均＜0.05）。②miR-195抑制心肌成纖維細胞增殖及分化:1.MiR-195的表達量隨細胞傳代次數(shù)增加而升高，在P3代的表達量顯著升高（p值均＜0.05）;2.激動劑轉染細胞后miR-195的表達量升高（p值均＜0.05），抑制劑轉染細胞后miR-195的表達下降（p值均＜0.05）;3.高表達miR-195后EDU、Ki67的陽性率及PCNA、α-SMA的表達量降低，降低miR-195后EDU

6、、Ki67的陽性率及PCNA、α-SMA的表達量升高，差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);4.MiR-195負向調節(jié)細胞周期基因Chek1，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。③MiR-195通過Chek1調控心肌成纖維細胞的增殖及分化:1.SiRChek1轉染細胞后Chek1的表達量明顯低于對照組（p值均＜0.05）。2.EDU的陽性率、α-SMA的表達量在siRChek1組、miR-195 antagomir與siRChek1共轉染組