PPARβ-δ激活對大鼠心肌成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、高血壓病是一種常見病、多發(fā)病，極易導(dǎo)致心、腦、腎等靶器官損害，嚴(yán)重威脅人類的健康。其中，由心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblast，CFs)增殖和膠原表達(dá)過多所導(dǎo)致的心肌纖維化是高血壓心室肥厚由代償向失代償轉(zhuǎn)化的重要病理過程，是引發(fā)心力衰竭的核心環(huán)節(jié)。目前心肌纖維化的確切發(fā)病機制并不十分明確，但近年來心肌纖維化的治療已成為國內(nèi)外研究的熱點。其中，過氧化物酶體增殖劑激活型受體(peroxisome proliferators-

2、activated receptors，PPARs)與心肌纖維化的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注。PPARα和PPARγ激活可以抑制心肌纖維化，但與它們結(jié)構(gòu)和功能相類似的PPARβ/δ對心肌纖維化的作用卻未見報道。 本研究旨在細(xì)胞水平模擬心肌纖維化，探索PPARβ/δ激活對血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)誘導(dǎo)的成年大鼠CFs膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響及其可能的機制，為心肌纖維化的治療提供新的作用靶點，以有利于抗心肌

3、纖維化藥物的研發(fā)。 第1章成年大鼠心肌成纖維細(xì)胞PPARβ/δ的表達(dá)情況。 目的： PPARβ/δ體內(nèi)分布廣泛，其中心臟PPARβ/δ表達(dá)水平較高。心臟主要由心肌細(xì)胞和CFs組成。心肌細(xì)胞表達(dá)PPARβ/δ，但CFs是否表達(dá)PPARβ/δ至今尚未見報道。本研究體外成功地培養(yǎng)了成年大鼠CFs，并在此基礎(chǔ)之上探討成年大鼠CFs是否表達(dá)PPARβ/δ。 方法： 1.采用膠原酶—胰酶—膠原酶消化和差速貼壁

4、法分離成年大鼠CFs。倒置顯微鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞，同時繪制細(xì)胞生長曲線了解生長特性。 2.以乳鼠心肌細(xì)胞作為陽性對照，采用RT-PCR和Westem blot研究成年大鼠CFs是否表達(dá)PPARβ/δ。 3.從mRNA水平研究CFs中PPARs 3個亞型的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.采用膠原酶—胰酶—膠原酶法分離細(xì)胞，細(xì)胞收率高，而且培養(yǎng)成本較低。倒置顯微鏡下，原代培養(yǎng)的CFs呈梭形或不規(guī)則三角形，胞

5、質(zhì)淡折光性強，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，無自發(fā)性搏動。培養(yǎng)的細(xì)胞波形蛋白染色陽性，Ⅷ因子染色陰性，α-actin染色陰性，符合CFs染色特征，細(xì)胞純度大于98﹪。第3-5代CFs的生長曲線無明顯差異，適于開展細(xì)胞實驗。 2.成年大鼠CFs在mRNA和蛋白兩個水平都檢測到PPARβ/δ表達(dá)，而且CFs的PPARβ/δ表達(dá)量較心肌細(xì)胞低(P<0.01)。 3.CFs同時表達(dá)PPARs 3個亞型，PPARβ/δ和。PPARα表達(dá)量

6、較高，而PPAR7表達(dá)量最低(P<0.01)。 結(jié)論： 我們建立的成年大鼠CFs培養(yǎng)方法成本較低，細(xì)胞收率較高，細(xì)胞純度高，第3-5代細(xì)胞適于開展相關(guān)實驗。成年大鼠CFs表達(dá)PPARβ/δ，而且在。PPARs 3個亞型中表達(dá)量較高。CFs表達(dá)PPARβ/δ是開展后續(xù)實驗的前提和基礎(chǔ)。 第2章GW501516對心肌成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響。 目的： PPARa和PPARγ激活可以抑制心肌纖

7、維化，但與它們結(jié)構(gòu)和功能相類似的PPARβ/δ對心肌纖維化的效應(yīng)卻未見報道。本研究成功地建立了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的成年大鼠CFs膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖的模型，并在此基礎(chǔ)之上探討PPARβ/δ激動劑GW501516對細(xì)胞膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響。 方法： 1.摸索AngⅡ刺激成年大鼠CFs膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖的量效和時效關(guān)系，建立AngⅡ誘導(dǎo)的CFs膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖模型。 2.利用MTT法探索成年大鼠CFs使用GW5015

8、16的安全劑量范圍。 3.采用Western blot、<'3>H-proline摻入和<'3>H-TdR摻入等方法，探討GW501516對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的成年大鼠CFs膠原表達(dá)、膠原合成和細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果： 1.(1-1000)nM Ang Ⅱ作用于CFs(6-36)h，可以濃度依賴和時間依賴地促進(jìn)CFs表達(dá)Ⅰ型膠原。(0.1-1000)nMAngⅡ作用于CFs(12-48)h，可以濃度依賴和時間依賴地增

9、加CFs對<'3>H-TdR的攝取量。 2.(1nM-1μM)GW501516對CFs的細(xì)胞數(shù)無影響(P>0.05 vs.對照組)，而10μM的GW501516明顯地降低CFs的細(xì)胞數(shù)(P<0.01 VS.對照組)。 3.(1nM-1μM)GW501516預(yù)處理CFs 1h，可以濃度依賴性地抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs膠原表達(dá)和膠原合成，而GW501516本身對細(xì)胞的膠原表達(dá)和膠原合成無影響。(1nM-1μM)GW5015

10、16濃度依賴性地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFs<'3>H-TdR的攝取，而GW501516不影響細(xì)胞對<'3>H-TdR的基礎(chǔ)攝取量。 結(jié)論： 成功建立AngⅡ誘導(dǎo)的CFs膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖的細(xì)胞模型。eeARβ/δ激動劑GW501516可以抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖，其中抑制細(xì)胞膠原表達(dá)的效應(yīng)與其降低細(xì)胞膠原的合成有關(guān)。 第3章PPARβ/δ激活介導(dǎo)GW501516對心肌成纖維細(xì)胞的效應(yīng)。 目

11、的： GW501516可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖。GW501516的效應(yīng)除可能通過激活PPARβ/δ來實現(xiàn)外，也可能通過調(diào)節(jié)PPARβ/δ的表達(dá)量或通過不依賴于PPARβ/δ的途徑來實現(xiàn)。本研究觀察了GW501516對CFs PPARβ/δ表達(dá)量的影響，并利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)來探索GW501516的作用是否依賴于PPARβ/δ。 方法： 1.采用RT-PC

12、R和Western blot探討GW501516是否影響CFs PPARβ/δ的表達(dá)量。 2.以Stealth RNAi Negative Control作為陰性對照，3對針對PPARβ/δ的Stealth siRNA(RSS340860、RSS340861和RSS340862)轉(zhuǎn)染CFs。轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，RT-PCR和Western blot檢測各組細(xì)胞PPARβ/δ的表達(dá)水平，篩選有效干擾序列。 3.有效干擾序列抑

13、制細(xì)胞PPARβ/δ表達(dá)后，采用Western blot、<'3>H-proline和<'3>H-TdR摻入等方法研究GW501516對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞膠原表達(dá)、膠原合成和細(xì)胞增殖的效應(yīng)有無變化。 結(jié)果： 1.GW501516、Ang Ⅱ和GW501516+Ang Ⅱ組細(xì)胞PPARβ/δ的表達(dá)量與對照組相比無差異(P>0.05)。 2.Negative Control不影響CFs PPAR~的表達(dá)(P>0.0

14、5 vs.對照組)。而3對Stealth siRNA都顯著地抑制細(xì)胞PPARβ/δ的mRNA和蛋白表達(dá)(p<0.01 vs.對照組)，其中RSS340860的抑制作用最強，分別降低PPARβ/δmRNA和蛋白表達(dá)83﹪和80﹪。 3.RSS340860抑制CFs PPARβ/δ表達(dá)后，逆轉(zhuǎn)了GW501516對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞膠原表達(dá)、膠原合成和細(xì)胞增殖的抑制作用(p<0.01 vs.GW501516+AngⅡ組)。而Nega

15、tive Control對GW501516的效應(yīng)無影響(p>0.05 vs.GW501516+AngⅡ組)。 結(jié)論： GW501516不影響CFs PPARβ/δ的受體表達(dá)量；RSS340860能顯著地抑制CFs PPARβ/δ的表達(dá)；GW501516對CFs的效應(yīng)具有PPARβ/δ依賴性。因此，PPARβ/δ激活介導(dǎo)了GW501516對CFs的效應(yīng)。 第4章初步探討PPARβ/δ激活所產(chǎn)生效應(yīng)的機制。

16、目的： 本實驗旨在研究PPARβ/δ激活所產(chǎn)生效應(yīng)的可能機制。以往的研究表明，Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖可能與其刺激細(xì)胞生成活性氧(reactiveoxygen species，ROS)有關(guān)。而PPARγ激動藥通過調(diào)節(jié)細(xì)胞ROS的生成，可以抑制細(xì)胞膠原表達(dá)和細(xì)胞增殖。PPARβ/δ的效應(yīng)也可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞ROS的生成有關(guān)。 方法： 1．熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀測定GW501516是否影響Ang Ⅱ誘導(dǎo)

17、的CFsROS生成。 2．采用Western blot、<'3>H-proline摻入和<'3>H-TdR摻入等方法，探討ROS是否參與GW501516對CFs膠原表達(dá)、膠原合成和細(xì)胞增殖的抑制作用。 結(jié)果： 1．與對照組相比，AngⅡ組CFs ROS的生成顯著增加(p<0．01)，GW501516組細(xì)胞ROS的生成無明顯變化(p>0．05)。而GW501516預(yù)處理CFs后顯著地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFs ROS