外源性硫化氫對TGF-β1誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響及其可能機(jī)制.pdf

1、目的：探討外源性硫化氫對人胚肺成纖維細(xì)胞(human fetal lung fibroblast,HFL-F)轉(zhuǎn)化的影響及其可能的機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng) HFL-F MRC-5細(xì)胞至對數(shù)生長期，先加入TGF-β1(10μg/L)作用12h后，再加入不同濃度的硫氫化鈉（H2S的供體）作用一定時間，采用 MTT比色法檢測細(xì)胞的增殖，繪制12h、24h、48h時間點的增殖曲線圖，測定 NaHS對肺成纖維細(xì)胞增殖的影響，挑選出NaHS

2、最合適的作用濃度。把接種在培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對照組：細(xì)胞使用 MEM/NEAA培養(yǎng)基加10％FBS(Hyclone)培養(yǎng)；TGF-β1組：正常培養(yǎng)的HFL-F MRC-5細(xì)胞加入TGF-β1(10μg/1)作用24h；NaHS組(H2S供體)：用最適濃度的硫氫化鈉加入HFL-F MRC-5，刺激24h；NaHS+TGF-β1組：用TGF-β1(10μg/l)預(yù)先處理HFL-F MRC-512h，再加入最適濃度硫氫化鈉共孵育24

3、h。以上各組細(xì)胞，用Western blot法檢測ρ-Smad2/3和Smad3蛋白在0min、15min、30min及60min的表達(dá)水平，檢測24小時后α-SMA、I型膠原蛋白的表達(dá)水平。應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察正常細(xì)胞和加入TGF-β1(10μg/1)刺激后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并在0h、12h、24h、48h照相記錄。
　　結(jié)果：1.通過倒置相差顯微鏡可以看到，TGF-β1刺激后，肺成纖維細(xì)胞從多突的紡錘形或星形結(jié)構(gòu)，逐漸轉(zhuǎn)化為

4、扁平狀纖維結(jié)構(gòu)的肌成纖維細(xì)胞，隨著時間的延長，細(xì)胞增殖明顯。
　　2.與對照組相比，TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞12h后，加入不同濃度的硫氫化鈉（H2S的供體），細(xì)胞的增殖出現(xiàn)不同程度的減弱；與12h、48h組相比，24h組存活率最大，提示硫氫化鈉在50μmol/L~1200μmol/L濃度時對TGF-β1體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖有抑制作用，且存在一定的時間和劑量相關(guān)性。
　　3.與TGF-β1組比較，NaHS組及TGF-β

5、1+NaHS組肺成纖維細(xì)胞α-SMA、I型膠原蛋白明顯減弱，而NaHS組α-SMA、I型膠原蛋白的表達(dá)最低，說明外源性硫化氫對人胚肺成纖維細(xì)胞α-SMA和I型膠原蛋白的表達(dá)有下調(diào)作用，能夠抑制肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　4.與正常對照組比較，NaHS組肺成纖維細(xì)胞ρ-Smad2/3無差異性，而TGF-β1組肺成纖維細(xì)胞ρ-Smad2/3蛋白較NaHS+TGF-β1組表達(dá)明顯增多；與15min、60min相比，30min時

6、間點肺成纖維細(xì)胞ρ-Smad2/3蛋白表達(dá)的更明顯。
　　5.與對照組相比，NaHS組、TGF-β1組和NaHS+TGF-β1組肺成纖維細(xì)胞Smad3表達(dá)均上調(diào)，TGF-β1組Smad3蛋白表達(dá)上調(diào)更明顯。在同一試驗組中，15min時間點較30min、60min時間點肺成纖維細(xì)胞Smad3蛋白表達(dá)上調(diào)更明顯。在30min時間點，NaHS+TGF-β1組和NaHS組較TGF-β1組Smad3蛋白表達(dá)水平明顯降低。說明硫氫化鈉能夠下調(diào)