尿液、尿酸對(duì)人尿道成纖維細(xì)胞TGF-β1、Smad3影響實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 尿道損傷或尿道手術(shù)后尿道狹窄發(fā)生機(jī)率較高。至今，臨床上尚沒有切實(shí)的方法預(yù)防尿道狹窄，始終不能擺脫狹窄-擴(kuò)張/手術(shù).再狹窄的怪圈，給患者帶來極大的痛苦。尿道瘢痕組織是尿道創(chuàng)傷修復(fù)過程的產(chǎn)物，沒有瘢痕組織就不會(huì)有創(chuàng)面的愈合。但是瘢痕組織一旦生長(zhǎng)過度，就會(huì)產(chǎn)生尿道狹窄。目前研究發(fā)現(xiàn)：尿道狹窄組織存在典型的瘢痕過度增生改變。但對(duì)引起尿道瘢痕過度增生的影響因素不是很明確，因而缺乏有效的措施阻止尿道狹窄的發(fā)牛。 在對(duì)皮膚創(chuàng)面

2、瘢痕形成的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)：創(chuàng)面愈合過程中成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的增殖能力以及膠原大量分泌、沉積，其中以I型膠原纖維為主，認(rèn)為成纖維細(xì)胞過度表達(dá)及膠原的異常分泌是瘢痕產(chǎn)生的根本原因。成纖維細(xì)胞是最主要的修復(fù)細(xì)胞，在某些細(xì)胞趨化因子的作用下由創(chuàng)周向創(chuàng)面移位，合成、分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix ECM)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transform growth factor-beta TGF-β)是目前已知的與瘢痕形成

3、關(guān)系最密切的促膠原生成因子。TGF-p的主要生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和結(jié)締組織的合成。其中，TGF-β1在體細(xì)胞系中的TGF-β所占的比例最高(>90％)，活性最強(qiáng)，是成纖維細(xì)胞的強(qiáng)效趨化因子，可以通過旁分泌和自分泌直接或間接、單獨(dú)或協(xié)同、同時(shí)或不同時(shí)相作用于修復(fù)細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞的趨化性遷移、增生分化，細(xì)胞外基質(zhì)合成及分泌三類重要的生物學(xué)效應(yīng)。在增生性瘢痕中，TGF-β1的濃度明顯增高，且成纖維細(xì)胞對(duì)TGF-β1的敏感性也顯著增高。另外

4、，Smad3是與纖維化過程密切的一個(gè)下游信號(hào)蛋白，是介導(dǎo)TGF-β信號(hào)到細(xì)胞核內(nèi)的主要因子。TGF-β1、Smad3是研究增牛性瘢痕而經(jīng)常使用的重要指標(biāo)，在纖維化過程中也起到了關(guān)鍵作用。 尿道狹窄的病理學(xué)改變是創(chuàng)面過度修復(fù)，產(chǎn)生增生性瘢痕，進(jìn)而破壞尿道完整性，造成功能障礙。尿道作為尿液的輸出道，尿道損傷部位易受尿液的浸潤(rùn)刺激。我們?cè)谂R床上注意到，尿道下裂術(shù)后尿流改道患者，尿道瘢痕狹窄的發(fā)牛率較未改道患者低許多，其機(jī)理不十分清楚。

5、關(guān)于尿液在瘢痕形成中的作用報(bào)道不多，但對(duì)尿外滲導(dǎo)致腹膜后纖維化病變，眾多學(xué)者較為認(rèn)可。此外，有學(xué)者報(bào)導(dǎo)尿酸的過度沉積會(huì)引起某些沉積部位發(fā)生纖維化改變，如腎小管因尿酸鹽阻塞管腔會(huì)引起腎組織纖維化。這些提示我們，是否尿液、尿酸影響了尿道瘢痕的過度增生？在尿道創(chuàng)傷修復(fù)過程中，尿液、尿酸對(duì)尿道成纖維細(xì)胞TGF-β1、Smad3表達(dá)有何影響？本實(shí)驗(yàn)研究，我們收集尿道下裂術(shù)后尿道瘢痕組織和正常尿道組織，比較尿道瘢痕和正常尿道組織TGF-pi、Sma

6、d3表達(dá)差異；同時(shí)培養(yǎng)尿道瘢痕和正常尿道中的成纖維細(xì)胞，分析兩者TGF-pi、Smad表達(dá)差異；并用模擬生理濃度的尿液和尿酸，刺激正常尿道成纖維細(xì)胞，觀察細(xì)胞TGF-β1、Smad3因子表達(dá)變化，觀察尿液和尿酸刺激對(duì)成纖維細(xì)胞I型膠原分泌的影響，討論尿液、尿酸在尿道瘢痕形成中的作用，為臨床預(yù)防和治療尿道瘢痕狹窄提供理論依據(jù)。 方法： 收集尿道下裂術(shù)后瘢痕組織及正常尿道組織的標(biāo)本，通過HE染色進(jìn)行兩種組織的形態(tài)學(xué)比較；采用

7、免疫組化染色比較兩者TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)差異。 胰酶消化法培養(yǎng)尿道瘢痕和正常尿道中的成纖維細(xì)胞。通過免疫熒光染色和RT-PCR檢測(cè)技術(shù)比較兩者TGF-β1、Smad3蛋白和TGF-β1、Smad3 mRNA的表達(dá)差異。用適當(dāng)濃度的尿液和尿酸溶液刺激尿道成纖維細(xì)胞，比較刺激前后，細(xì)胞TGF-β1、Smad3蛋白及TGF-β1、Smad3 mRNA變化情況；用ELISA方法觀察尿液、尿酸刺激成纖維細(xì)胞前后I型膠原分泌變化

8、情況。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.HE染色：與正常尿道組織相比，尿道瘢痕病理學(xué)特點(diǎn)為管腔變窄、不規(guī)則，尿道粘膜上皮變薄，甚至消失。尿道海綿體的血管竇結(jié)構(gòu)被多數(shù)的纖維結(jié)締組織所代替，膠原纖維排列較為紊亂，可見大量肥大的成纖維細(xì)胞。 2.體外培養(yǎng)的尿道瘢痕成纖維細(xì)胞和正常尿道成纖維細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭形，波形蛋白(+)，角蛋白(-)，確定為實(shí)驗(yàn)所需的成纖維細(xì)胞。 3.尿液、尿酸刺激對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖有顯著促進(jìn)作用。

9、 4.尿道瘢痕成纖維細(xì)胞I型膠原表達(dá)高于正常尿道成纖維細(xì)胞；尿液及尿酸刺激后，正常尿道成纖維細(xì)胞I型膠原表達(dá)明顯升高。 5.正常尿道成纖維細(xì)胞TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)較低，主要表達(dá)在胞漿；尿道瘢痕成纖維細(xì)胞TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)升高；且TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。這提示TGF-β1、Smad3是瘢痕形成的重要因子。 6.受尿液、尿酸刺激后，正常尿道成纖