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文檔簡介
1、目的: 研究SiRNA沉默TGF-β RII對體外培養(yǎng)人瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響及誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞凋亡，為臨床增生性瘢痕的防治提供科學(xué)的實驗依據(jù)。 方法: 用DNA重組技術(shù)將針對人TGF-βⅡ型受體基因不同部位所設(shè)計的3對shRNA序列克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pSilencerTM 3.1-H1neo vector中，構(gòu)建TGF-βⅡ型受體shRNA表達(dá)載體pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRII shRN
2、A1、2、3。脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人原代成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418篩選抑制TGF-βⅡ型受體表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞克隆。實驗采用MTT檢測SiRNA沉默TGF-βRII對體外培養(yǎng)人瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響，通過Giemsa染色、流式細(xì)胞儀及基因組DNA電泳檢測SiRNA沉默TGF-βRII誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞凋亡。 結(jié)果: 3個TGF-βⅡ型受體shRNA表達(dá)載體pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRII shRNA1、2、3經(jīng)限制
3、性酶切及序列分析證明基因插入正確。RT-PCR、Western blotting均證實：3種shRNA重組質(zhì)粒中pSilencerTM 3.1-H1-TGF-βRII shRNA2可明顯降低細(xì)胞內(nèi)TGF-βⅡ型受體mRNA豐度及TGF-βⅡ型受體蛋白表達(dá)。選擇采用pSilencerTM 3.1-H1-TGF-βRⅡ shRNA2作用于體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞24h、48h、72h后，可抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，并出現(xiàn)成纖維細(xì)
4、胞突出變短、變少，胞核、胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)邊集，呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡率為18.4％，與對照組比較，差異有顯著性；1.5％瓊脂糖電泳結(jié)果出現(xiàn)DNA梯子，以作用48小時最為明顯。 結(jié)論: 成功構(gòu)建了TGF-βⅡ型受體shRNA表達(dá)載體pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRⅡ shRNA1、2、3，并篩選出特異而高效地阻斷TGF-βⅡ型受體表達(dá)的克隆。 在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞
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