建立人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞力學(xué)模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　以機(jī)械張力誘導(dǎo)人正常皮膚成纖維細(xì)胞（Normal Skin Fibroblasts, SFB）建立增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（Hypertrophic Scar Fibroblasts, HSFB）模型。
　　方法:
　　取瘢痕切除植皮術(shù)的3例增生性瘢痕患者自愿捐贈(zèng)的增生性瘢痕處和正常皮膚處真皮組織，應(yīng)用組織塊法體外分離培養(yǎng)NSFB及HSFB，取第3-8代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。NSFB和HSFB分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)

2、驗(yàn)組加載0.1Hz，10%拉伸幅度的正弦波形周期性機(jī)械張力，以加載時(shí)間分為3、5、7天組；對(duì)照組細(xì)胞不加載機(jī)械張力培養(yǎng)相同時(shí)長(zhǎng)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各處理組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及增值情況；酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清液中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（Transforming Growth Factor-β1, TGF-β1）和Ⅰ型膠原含量；SYBR

3、Green實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（Real-time Quantitative PCR Detecting System, qPCR）檢測(cè)細(xì)胞p130Crk-associated substance（P130Cas）、整合素-β1（Integrin-β1）、TGF-β1、Ⅰ型前膠原和α-平滑肌動(dòng)蛋白（α-Smooth Muscle Actin,α-SMA）mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；蛋白質(zhì)印記法（Western Blot, WB）半定

4、量檢測(cè)細(xì)胞P130Cas、Integrin-β1蛋白表達(dá)情況。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采取單因素方差分析，兩兩比較采取S-N-Ka檢驗(yàn)。P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1）細(xì)胞形態(tài)：加載機(jī)械張力后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖旺盛，排列有一定方向性。對(duì)照組細(xì)胞增殖速度較慢，排列無(wú)序，呈菊花團(tuán)樣。2）ELISA結(jié)果：加載5天時(shí)，NSFB實(shí)驗(yàn)組與HSFB對(duì)照組細(xì)胞TGF-β1、Ⅰ型前膠原分泌量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

5、義（P＞0.05），與NSFB對(duì)照組及HSFB實(shí)驗(yàn)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。加載機(jī)械張力3天及7天時(shí)，NSFB實(shí)驗(yàn)組與HSFB對(duì)照組、NSFB對(duì)照組及HSFB實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TGF-β1、Ⅰ型前膠原分泌量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；加載3天時(shí)，NSFB實(shí)驗(yàn)組TGF-β1、Ⅰ型膠原分泌量低于HSFB對(duì)照組，加載7天時(shí)，NSFB實(shí)驗(yàn)組TGF-β1、Ⅰ型膠原分泌量高于HSFB對(duì)照組。3）SYBR Green qPCR結(jié)

6、果：加載3天時(shí)，NSFB實(shí)驗(yàn)組與NSFB對(duì)照組細(xì)胞P130Cas、Integrin-β1、TGF-β1和Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；α-SMA mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。加載5天時(shí)，NSFB實(shí)驗(yàn)組與HSFB對(duì)照組細(xì)胞P130Cas、Integrin-β1、TGF-β1、Ⅰ型前膠原和α-SMA mRNA表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與NSFB對(duì)照組及HSFB

7、實(shí)驗(yàn)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。加載7天時(shí)，NSFB實(shí)驗(yàn)組與HSFB對(duì)照組、NSFB對(duì)照組及HSFB實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞P130Cas、Integrin-β1、TGF-β1、Ⅰ型前膠原和α-SMA mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4）WB結(jié)果：加載機(jī)械張力3天時(shí)，NSFB實(shí)驗(yàn)組與NSFB對(duì)照組P130Cas、Integrin-β1蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。加載機(jī)械張力5天時(shí)，NSFB實(shí)驗(yàn)組

8、與HSFB對(duì)照組細(xì)胞P130Cas、Integrin-β1蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與NSFB對(duì)照組及HSFB實(shí)驗(yàn)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。加載機(jī)械張力7天時(shí)，NSFB實(shí)驗(yàn)組與HSFB對(duì)照組、NSFB對(duì)照組及HSFB實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞P130Cas、Integrin-β1蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　加載0.1Hz，10%拉伸幅度的正弦波形周期性機(jī)械張