饑餓誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞自噬發(fā)生.pdf

1、目的:觀察由饑餓誘導(dǎo)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞自噬發(fā)生，并探討其發(fā)生機(jī)制及意義，為研究增生性瘢痕的形成機(jī)制與自噬之間的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并進(jìn)一步為其臨床防治提供新的治療靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1.增生性瘢痕的取材及細(xì)胞培養(yǎng)手術(shù)中切取人增生性瘢痕組織9例，取自創(chuàng)面愈合后12個(gè)月以?xún)?nèi)的增生性瘢痕，色澤紅、質(zhì)硬、高出皮膚表面，局部無(wú)感染和潰瘍，且均未曾治療，患者知情同意，無(wú)腫瘤、結(jié)締組織疾病等。采用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)增生性瘢

2、痕成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)用第3～7代細(xì)胞。
　　 2.細(xì)胞處理及分組取對(duì)數(shù)期增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，用EBSS(Earle's balanced salt)代替培養(yǎng)液，分別饑餓處理1h、2h、3h。對(duì)照組繼續(xù)用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。
　　 3.Western blot和熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)各組成纖維細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC3

3、)和自噬相關(guān)蛋白Beclin-i的蛋白及基因表達(dá)。
　　 4.單丹磺酰戊二胺(MDC)染色和透射電鏡觀察成纖維細(xì)胞內(nèi)自噬體結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:
　　 1.Western blot檢測(cè)LC3和Beclin-1的蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，饑餓處理1h后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1/GAPDH增高，饑餓2h組達(dá)高峰，3h組則呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Beclin-1在饑餓處理1h后表達(dá)增高，2h

4、達(dá)到高峰后逐漸下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.熒光定量RT-PCR檢測(cè)LC3和Beclin-1的mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LC3 mRNA表達(dá)在饑餓處理1h后即有增高，2h達(dá)到達(dá)到高峰，3h下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; Beclin-1 mRNA在饑餓處理1h后表達(dá)增高，2h達(dá)到高峰后3h逐漸下降，與對(duì)照組相比差異有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.MDC熒光染色觀察MDC熒光染料作為自噬泡的示蹤劑，在熒光顯

5、微鏡下呈藍(lán)綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，多分布于核周。對(duì)照組細(xì)胞中可見(jiàn)少量的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu);而饑餓處理2h后，MDC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多。計(jì)算對(duì)照組饑餓2h組的自噬細(xì)胞百分率分別為3.4±1.4、65.7±7.4。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)透射電鏡下，對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞核較大，核仁明顯，胞漿內(nèi)清晰可見(jiàn)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。而饑餓處理2h后細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量囊泡狀結(jié)構(gòu)，在高倍電鏡下可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)，包含未消化的胞漿成分及碎裂的細(xì)胞