三七總甙對人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗研究.pdf

1、增生性瘢痕(hypertrophic-scar,HS)是創(chuàng)傷后，尤其是深度燒傷后最常見的一種病理性愈合現(xiàn)象。實(shí)質(zhì)是以成纖維細(xì)胞(Fibroblasts)為主的細(xì)胞增殖、活性增強(qiáng)，產(chǎn)生大量的膠原蛋白，使含Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellarmatrix，ECM)成分在組織中大量沉積，而難以被機(jī)體吸收或重塑的病理狀態(tài)。目前所知與外傷、燒傷、手術(shù)、感染、異物、機(jī)體局部膠原代謝失調(diào)、遺傳及局部免疫功能等多種因素有關(guān)。臨床上常用的

2、治療方法：手術(shù)治療、加壓療法、硅膠薄膜敷貼、局部激素注射治療、冷凍治療、激光療法和其它藥物治療，多方法聯(lián)合治療效果較好。盡管這些治療方法在不同程度上可以減輕癥狀，但是存在著一定的局限性及各種副作用，很難獲得理想地治療效果。因此尋求有效地防治增生性瘢痕的方法是創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域的重要課題。中藥治療增生性瘢痕具有來源廣泛，價格低廉，長期使用毒副作用輕微等特點(diǎn)，但其療效不很確切，機(jī)制仍不很清楚，有待于進(jìn)一步探討。本實(shí)驗在前期研究基礎(chǔ)上觀察三七總甙(

3、Panaxnotogi-noside,PNS)對體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(hypertrophic-scarFibroblastsHSFb)的抑制作用，為臨床上防治增生性瘢痕提供實(shí)驗依據(jù)。 方法：取增生性瘢痕標(biāo)本共10例，其中男性5例，女性5例，年齡3-35歲。體外培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞120瓶，按實(shí)驗設(shè)計隨機(jī)分為空白組(無血清的DMEM培養(yǎng)基)、對照組(新配制的10％小牛血清DMEM培養(yǎng)基)、PNS給藥組(PNS終

4、濃度為400ug/ml的10％小牛血清DMEM培養(yǎng)基)，每組40瓶。每組均分為12h、24h、48h及72h時像點(diǎn)，每個時像點(diǎn)分10瓶。檢測指標(biāo)：1.HE染色觀察HSFb的細(xì)胞形態(tài)變化；2.原代培養(yǎng)HSFb描繪細(xì)胞生長曲線；3.利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的改變；4.應(yīng)用MTT比色法在檢測細(xì)胞增殖率的變化；5.三維培養(yǎng)HSFb細(xì)胞并記錄膠原收縮指數(shù)；6.免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測HSFb中TGF-β1和α-SMA的表達(dá)。 結(jié)果：1.HE

5、染色觀察HSFb的形態(tài)變化：體外培養(yǎng)的HSFb典型長梭形，胞體較大，胞漿豐富胞突多，呈多角型，胞核大，處于核分裂期細(xì)胞多，細(xì)胞走向趨于一致。PNS處理組HSFb隨著藥物作用時間的延長數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞胞體變小，胞突少，梭狀突起回縮，與鄰近細(xì)胞接觸減少，細(xì)胞雙極變得尖細(xì)，有的只剩單極。 2.繪制HSFb的生長曲線：對照組和空白組繪制的細(xì)胞生長曲線近似“S”型，接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)第一天細(xì)胞數(shù)量相對減少，經(jīng)過5天的潛伏期后，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生

6、長期，到了第10天以后細(xì)胞數(shù)量開始下降，進(jìn)入了衰老期。而給藥組細(xì)胞生長曲線近似一條直線，隨著給藥的時間延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。 3.PNS對HSFb細(xì)胞周期的影響：將對照組和400ug/mlPNS給藥組在12h、24h、48h和72h后，細(xì)胞周期各時像進(jìn)行比較，400ug/mlPNS給藥組S期細(xì)胞比數(shù)明顯高于對照組，而G0-Gl期和G2-M期細(xì)胞比數(shù)明顯低于對照組，將PNS給藥組和對照組各時相細(xì)胞數(shù)的進(jìn)行比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有非常

7、顯著性差異(P＜0.01)。PNS作用于HSFb其DI值均在1.0±0.1范圍，屬二倍體細(xì)胞。 4.PNS對HSFb增殖率的影響：400ug/ml的PNS作用12小時后即對細(xì)胞有抑制作用。HSFb給藥組細(xì)胞增殖數(shù)明顯低于HSFb空白組和對照組，HSFb給藥組和空白組之間出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，對照組和給藥組之間出現(xiàn)明顯差異(P＜0.01)。 5.PNS對膠原收縮基質(zhì)的抑制作用：隨著給藥時間的延長，三組細(xì)胞均有收縮

8、現(xiàn)象的發(fā)生，但是收縮的程度不同，根據(jù)測量的結(jié)果計算的收縮指數(shù)，對照組最高為77.94而實(shí)驗組最低為48.56，兩組間出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。 6.PNS對HSFb中TGF-β1表達(dá)的抑制作用：隨著給藥時間的延長，三組細(xì)胞中對照組和空白組TGF-β1表達(dá)逐漸上升，對照組的上升幅度大于空白組，但兩組之間的比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異。實(shí)驗組細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)強(qiáng)度隨時間的延長呈下降趨勢，與對照組比較具有顯著性差異(P＜0.05)；與

9、空白組比較有差異(P＜0.01)。 7.PNS對HSFb中α-SMA表達(dá)的抑制作用 隨給藥組時間的延長，對照組和空白組細(xì)胞中α-SMA的陽性表達(dá)增高。給藥組細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)明顯下降，與對照組有差異顯著(P＜0.05)。 結(jié)論：本實(shí)驗通過對體外培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞不同指標(biāo)的檢測，證實(shí)三七總甙對人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞有顯著的抑制作用，其抑制作用可能與以下幾個方面有關(guān)： 1.PNS可改變細(xì)胞形態(tài)；