JAK-STATs通路對CTGF刺激人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖分化作用的研究.pdf

1、增生性瘢痕是燒傷、整形乃至整個創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域亟待解決的難題之一，成纖維細(xì)胞是其發(fā)病的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，生長因子對成纖維細(xì)胞的增殖、分化具有重要的調(diào)控作用。結(jié)締組織生長因子(CTGF)是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有強烈促纖維化作用的生長因子，有研究證[1]，CTGF能促進(jìn)體外增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(HSF)增殖及其向肌成纖維細(xì)胞(MyoF)的轉(zhuǎn)分化，但其細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制尚不清楚，未見相關(guān)報道。JAK-STATs通路是近幾年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子信息內(nèi)傳的非常重要

2、的一條通路，是參與人體內(nèi)部分生理(如造血)和病理反應(yīng)(如部分腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腦損傷、支氣管哮喘等)的共同通路之一，已證實與多種疾病發(fā)生發(fā)展及防治密切相關(guān)[2-5]。目前已知有多種細(xì)胞因子(如干擾素-α、β、γ，白細(xì)胞介素-2、4、6等)、生長因子(表皮生長因子、血小板衍生生長因子等)、生長激素、瘦素等通過JAK-STATs途徑進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)控部分細(xì)胞的增殖分化過程。鑒于以上原因，我們選擇其作為參與CTGF調(diào)控人增生性瘢痕成纖維細(xì)

3、胞增殖分化過程的信號通路進(jìn)行篩選鑒定。 方法： 本研究通過原代培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，將對象分為①對照組：人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞組；②CTGF刺激人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞組。采用Western blot、免疫熒光化學(xué)染色、凝膠阻滯電泳(EMSA)、RT-PCR方法，分以下兩大部分進(jìn)行研究，第一大部分為J A K-S T A T s信號分子的初步篩選，包括①取0min、5 min、10 min、20 min、30 min

4、、45 min、60 min、90 min八個時相點，采用western-blot方法檢測各時相點JAK1、JAK2、JAK3、TYK2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6十類蛋白活化(磷酸化)情況，并篩選出對CTGF刺激其磷酸化程度呈反應(yīng)性增高的蛋白(JAK1、STAT1)；②對篩選出來的蛋白(STAT1)用免疫熒光化學(xué)染色方法觀察其胞漿到胞核的核轉(zhuǎn)位的時相變化并比較組間差異；③利用凝膠阻滯電泳(E

5、MSA)方法進(jìn)一步驗證此蛋白(STATl)與D N A的結(jié)合能力及持續(xù)時間。第二大部分，將對象分為四組：①STAT1 ASODN+CTGF組：②CTGF刺激組；③STAT1 ASODN轉(zhuǎn)染組；④空白對照組。在上述研究基礎(chǔ)上，對篩選出的信號分子(STAT1)應(yīng)用特異性抑制劑(STAT1ASODN)進(jìn)行阻斷，用MTT法測定各組間細(xì)胞增殖差異，RT-PCR觀察α-SMA的表達(dá)以反映人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化情況，以了解STAT

6、1對CTGF調(diào)控人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖分化過程的影響。 結(jié)果： CTGF刺激人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞后JAK-STATs通路所有蛋白(總蛋白以“t-”表示)均以非磷酸化和磷酸化(以“p-”表示)兩種形式存在，在起始狀態(tài)下即出現(xiàn)磷酸化條帶，之后其磷酸化程度逐漸增強，在30min左右達(dá)峰值，再隨時間延長逐漸下降呈一倒拋物線。Western blot顯示胞漿及胞核中“p-JAK1/t-JAK1”比值和“p-STAT1/t-

7、STAT1”比值隨CTGF作用時間延長逐漸增大，至30min時達(dá)最強，之后逐漸下降。其余JAK-STATs蛋白雖均有不同程度的磷酸化，但并未隨CTGF刺激出現(xiàn)反應(yīng)性增強趨勢。應(yīng)用免疫熒光化學(xué)染色法檢測STAT1的核轉(zhuǎn)位，發(fā)現(xiàn)磷酸化STAT1蛋白在刺激30min左右達(dá)最強，比較組間差異發(fā)現(xiàn)：瘢痕成纖維細(xì)胞組(++)：熒光明亮，胞漿、胞核分布基本一致；CTGF刺激瘢痕成纖維細(xì)胞組(+++-++++)：熒光閃亮，呈明顯的亮綠色，胞核中熒光強度

8、增加，核聚集現(xiàn)象明顯；應(yīng)用凝膠阻滯電泳法，采用不同濃度CTGF刺激時發(fā)現(xiàn)檢測STAT1與DNA的結(jié)合能力呈CTGF濃度依賴趨勢，當(dāng)CTGF10ng/ml時達(dá)到峰值。同時，我們用10ng/ml CTGF刺激人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞在不同時相點(0、10、20、30、45、60、90、120min)STAT1與DNA的結(jié)合能力及持續(xù)時間時發(fā)現(xiàn)：當(dāng)CTGF刺激10min時，SIF已開始活化，45-60min達(dá)峰值，之后逐漸減弱，且較對照組明顯增

9、強。根據(jù)以上結(jié)果，初步篩選出JAK1、STAT1蛋白為參與CTGF調(diào)控人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖分化過程的信號分子。 為進(jìn)一步驗證上述結(jié)論，我們將對象分為四組：①STAT1 ASODN+CTGF組；②CTGF刺激組；③STAT1 ASODN轉(zhuǎn)染組：④空白對照組，觀察STAT1對CTGF調(diào)控人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖分化過程的影響。在RT-PCR確定STAT1 ASODN已成功轉(zhuǎn)入的前提下，用MTT測定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖程度變化時發(fā)

10、現(xiàn)，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖程度呈②>④>①③的趨勢變化，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖明顯受到抑制，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時，我們采用RT-PCR比較轉(zhuǎn)染前后a-SMA的差異，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染前后a-SMA/GAPDH條帶灰度值無明顯差異(P>0.05)，結(jié)果不具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1、在CTGF促進(jìn)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)分化的同時，JAK1和STAT1蛋白被不同程度活化，其活化程度隨CTGF的刺激反應(yīng)性增強，胞核

11、中磷酸化STAT1熒光強度明顯增加，核聚集現(xiàn)象明顯；STAT1與DNA的結(jié)合能力增強。 2、STAT1 ASODN轉(zhuǎn)染后人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖能力明顯下降，但并未完全抑制其增殖過程； 3、STAT1 ASODN轉(zhuǎn)染后人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化能力則未見明顯改變。 以上研究結(jié)果提示：STAT1參與了CTGF調(diào)控人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖過程，但并非是唯一途徑；而JAKl則可能作為其上游因子，通