RNAi抑制PTN對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、由于缺乏有效的防治手段，皮膚創(chuàng)傷后形成的病理性瘢痕是目前整形手術(shù)面臨的臨床難題之一。增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)的形成機(jī)理目前尚不十分明確，一般觀點(diǎn)認(rèn)為，是由于皮膚受到創(chuàng)傷后，由于各種因素引起成纖維細(xì)胞(Fibroblast，F(xiàn)b)的增殖異常，使膠原蛋白合成失控，進(jìn)而導(dǎo)致膠原在細(xì)胞外基質(zhì)中的大量沉積所形成的。因此，研究增生性瘢痕形成過(guò)程中與成纖維細(xì)胞異常增殖有關(guān)因子的表達(dá)，對(duì)于闡明增生性瘢痕的形成機(jī)制，以及臨床

2、上探索增生性瘢痕的新的治療手段均具有十分重要的意義。一些研究表明，主要是由Fb、生長(zhǎng)因子和ECM的共同作用導(dǎo)致了HS的發(fā)生以及發(fā)展，因此如何控制生長(zhǎng)因子的調(diào)控作用，有效的抑制成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是增生性瘢痕(HS)防治研究的重要途徑。
　　 pleiotrophin(PTN)是由Milner等人于1989年從圍產(chǎn)期鼠腦組織中純化得到的一種肝素結(jié)合蛋白[1]。此后的研究表明PTN也存在于一些非神經(jīng)組織，如子宮，心臟，

3、軟骨組織等，其主要生理功能是刺激細(xì)胞增殖與遷移，促進(jìn)血管生成，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)及骨發(fā)育等[2]。最近，Paddock等人利用表達(dá)譜芯片發(fā)現(xiàn)PTN在增生性瘢痕中也呈現(xiàn)高表達(dá)[3]，但是PTN對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響尚不清楚。
　　 基于以上研究背景，本研究通過(guò)檢測(cè)PTN在增生性瘢痕組織及正常皮膚組織中的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證PTN的過(guò)表達(dá)是否參與了增生性瘢痕的形成。此外還通過(guò)體外培養(yǎng)瘢痕成纖維細(xì)胞，利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)PTN的表達(dá)

4、，并檢測(cè)PTN表達(dá)下調(diào)對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探討PTN是否通過(guò)促進(jìn)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖參與病理性瘢痕的形成。
　　 一、臨床樣本病理檢測(cè)
　　 目的:增生性瘢痕(Hypertrophic scar，HS)發(fā)病機(jī)制尚未明確，普遍認(rèn)為是成纖維細(xì)胞的增生及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積等共同作用的結(jié)果，Pleiotrophin(PTN)是一種高度保守的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的分泌蛋白，作為一種原癌基因具有多種生物功能，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較正常

5、皮膚組織和增生性瘢痕組織中PTN是否存在差異表達(dá)，探討PTN在增生性瘢痕形成過(guò)程中起到的作用及意義。
　　 方法:隨機(jī)抽取術(shù)后的增生性瘢痕患者，以相應(yīng)正常皮膚組織作為對(duì)照，通過(guò)病理學(xué)HE和Masson染色觀察組織形態(tài)變化，通過(guò)RT-PCR、Western Blot和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PTN在增生性瘢痕組織的表達(dá)量與表達(dá)位置。
　　 結(jié)果:RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，與正常皮膚組織相比，PTN在病理性

6、瘢痕組織中表達(dá)量有所升高，且與皮膚正常組織之間存在顯著性差異(P＜0.01)。免疫組化結(jié)果顯示，PTN在皮膚真皮和表皮細(xì)胞中均有表達(dá)，且在增生性瘢痕組織中表達(dá)呈現(xiàn)陽(yáng)性。
　　 結(jié)論:依據(jù)分子和蛋白水平檢測(cè)結(jié)果推斷PTN可能參與了增生性瘢痕組織的形成過(guò)程。從病理免疫組化結(jié)果和染色結(jié)果顯示，PTN極有可能參與到細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積和成纖維細(xì)胞的增殖過(guò)程中，從而促進(jìn)增生性瘢痕的形成。有望將PTN作為增生性瘢痕治療的靶點(diǎn)，為增生性瘢痕的

7、治療提供新的途徑
　　 二、PTN s iRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建、制備、鑒定以及干擾片段的篩選
　　 目的:篩選PTN可能的干擾靶點(diǎn)，構(gòu)建、制備PTN siRNA重組質(zhì)粒。體外分離并培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，向其轉(zhuǎn)染PTN siRNA重組質(zhì)粒，篩選干擾效率最佳的一組，大量純化用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。
　　 方法:參照siRNA設(shè)計(jì)原則，選擇的PTN特異性干擾靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建重組質(zhì)粒（經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證），轉(zhuǎn)化于大腸桿菌

8、DH5α中擴(kuò)大培養(yǎng)，以無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取高純度重組質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染進(jìn)瘢痕成纖維細(xì)胞，Western Blot、RT-PCR方法檢測(cè)PTN表達(dá)水平變化，選擇干擾效果最佳的一組質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果:測(cè)序結(jié)果證明質(zhì)粒構(gòu)建成功，質(zhì)粒提取量達(dá)到細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需劑量。編號(hào)pGCsi-PTN-sh3的干擾質(zhì)粒對(duì)PTN表達(dá)的抑制率達(dá)70％以上，選擇其進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)論:體外成功構(gòu)建了PTN siRNA

9、重組質(zhì)粒，并能提供細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需足量高純度質(zhì)粒。篩選出干擾效果符合實(shí)驗(yàn)要求的目標(biāo)質(zhì)粒，可以進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
　　 三、RNAi法下調(diào)PTN表達(dá)對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的影響
　　 目的:將經(jīng)實(shí)驗(yàn)篩選的PTN干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)瘢痕成纖維細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一系列細(xì)胞、分子、蛋白水平檢測(cè)分析PTN表達(dá)下調(diào)對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及相關(guān)基因的影響。
　　 方法:MTT、細(xì)胞周期及凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTN表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，RT-PC

10、R，Western Blot檢測(cè)PTN siRNA重組質(zhì)粒對(duì)靶基因PTN的干擾效果，細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:將RT-PCR，Western Blot篩選出對(duì)PTN干擾效果達(dá)到70％以上的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至瘢痕成纖維細(xì)胞后，可有效抑制PTN表達(dá)，同未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖受到抑制(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，PTN干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡比率明顯高

11、于對(duì)照組(P＜0.05)。RT-PCR，Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，PTN表達(dá)下調(diào)后，細(xì)胞內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原含量較對(duì)照組顯著降低。
　　 結(jié)論:PTN是一種分泌性生長(zhǎng)因子，在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，研究發(fā)現(xiàn)PTN能夠刺激細(xì)胞增殖、遷移、促進(jìn)血管生成，瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染PTN siRNA重組質(zhì)粒后，PTN表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞增殖被抑制，細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白的合成相比對(duì)照細(xì)胞下調(diào)明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為我們提供了抑制增生性瘢痕形成的可能靶