RNAi抑制病理性瘢痕成纖維細胞Ⅰ型膠原的合成.pdf

1、增生性瘢痕(Hypertrophicscar,HS)與瘢痕疙瘩(Keloid，K)是常見的病理性瘢痕，一般認為它們是由創(chuàng)傷引起，以膠原等大量細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)的過度產生和沉積為特征的皮膚纖維增生性疾病，其發(fā)病率較高，且病理性瘢痕形成后無論在功能上還是外觀上都給患者身心健康帶來極大的危害。病理性瘢痕的發(fā)病機制目前尚未完全清楚，雖然人們對其病因及治療作了大量的研究，但至今仍未獲得有效的治療手段。隨著

2、基因工程技術的迅猛發(fā)展，使得基因治療成為醫(yī)學領域全新的治療手段，特別是前幾年才被發(fā)現(xiàn)的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術，一經發(fā)現(xiàn)即成為科學界的新寵，并為分子醫(yī)學帶來翻天覆地的變化。本文將采用以質粒為載體的RNAi技術，從基因治療的角度，以體外培養(yǎng)的人病理性瘢痕成纖維細胞為研究對象，針對病理性瘢痕形成與發(fā)展的重要環(huán)節(jié)-膠原代謝開展實驗。探索病理性瘢痕基因治療的新策略。 [方法]根據人Ⅰ型膠原α1鏈(COL

3、1α1)基因序列及二級結構特征，借助網上RNAi設計工具尋找4個干擾位點，并經過BLAST確定與其它基因不存在同源性。人工合成4對正反義脫氧寡核苷酸鏈，退火，定向克隆至含小鼠mU6啟動子的真核表達質粒載體pmU6中。電泳法初步篩選陽性重組克隆，并經DNA測序驗證重組克隆質粒插入序列的正確性。抽提和純化已鑒定的質粒，根據260nm紫外光吸收值及其與280nm紫外光吸收值的比值計算重組質粒的濃度和純度。MTT法觀察質粒載體與及轉染試劑對成纖

4、維細胞(FB)生長增殖的影響。通過將重組質粒與綠色熒光蛋白表達質粒pEGFP-N1在脂質體LipofectamineTM2000介導下共轉染的方法，熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測轉染效果。RT-PCR檢測RNAi對COL1α1基因mRNA水平的影響，以羥脯氨酸檢測試劑盒測定Ⅰ型膠原合成的變化。 [結果]成功構建了針對人COL1α1基因的shRNA表達質粒，并且各陽性克隆均能正確測序，DNA測序結果表明各重組質粒的序列符合預期要求。抽

5、提和純化后，各質粒的純度和濃度均通過測定，能滿足轉染的要求。較高的細胞接種密度(6孔板5.0×105/孔)適合轉染且LipofectamineTM2000及質粒對成纖維細胞的毒性不明顯。經LipofectamineTM2000介導共轉染后，shRNA表達質粒的轉染效率都比較高，達50％左右。半定量RT-PCR技術測定發(fā)現(xiàn)，各shRNA質粒轉染組COL1α1mRNA轉錄水平有不同程度的下調。與對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義。RNAi作用效果

6、經羥脯氨酸檢測試劑盒測定膠原水平證實。 [結論]成功構建了4個針對人Ⅰ型膠原α1鏈(COL1α1)基因的shRNA真核表達質粒。6孔板接種5.0×105細胞/孔的密度最適于轉染。由LipofectamineTM2000介導各質粒的瞬時轉染效率均較高。所構建的shRNA表達框架質粒能特異且有效地下調COL1α1基因的表達，從而成功抑制了病理性瘢痕成纖維細胞Ⅰ型膠原的合成。本實驗研究結果顯示RNA干擾技術可作為病理性瘢痕基因治療研究