CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達及其對瘢痕疙瘩成纖維細胞影響的研究.pdf

1、瘢痕疙瘩是整形外科常見疾病之一,也是尚未解決的問題之一,治療效果多年來沒有顯著的提高。瘢痕疙瘩的發(fā)生具有明顯的個體差異和家族傾向,生物學特性十分復雜,其根本形成機制迄今尚未清楚,是整形外科重要的基礎研究之一。大量的遺傳流行病學研究和分子遺傳學研究均表明瘢痕疙瘩的形成與相關遺傳基因的表達異常具有非常密切的關系。既往研究顯示,1號染色體的短臂術端匯集了許多與細胞生長,增殖,分化相關的基因,已有大量報道在許多腫瘤中該區(qū)存在缺失,其缺失頻率位于

2、36％～80%之間。尋找相關調(diào)控基因在瘢痕疙瘩發(fā)病機制中的作用已成為當前瘢痕疙瘩研究的熱點之一[1]。因此深入研究以期從基因水平闡明瘢痕疙瘩的發(fā)病機制,篩選出瘢痕疙瘩形成或抑制的相關調(diào)控基因,為瘢痕疙瘩發(fā)病機理研究和指導臨床有效的預防與治療提供線索和依據(jù),具有十分顯著的現(xiàn)實意義。
　　 CDC2L1基因是編碼p34Cdc2蛋白激酶家族中的一員。p34Cdc2蛋白激酶家族成員眾所周知調(diào)控真核細胞周期的要素。CDC2L1基因與CDC

3、2L2基因緊密相鄰,在同一染色體相同區(qū)域上[2,3]。這個基因位點包括CDC2L1基因,CDC2L2基因及金屬蛋白酶MMP21/22,構(gòu)成一個大的重復基因組兩個相同串聯(lián)連接區(qū)域的一部分。CDC2L1基因和CDC2L2基因在神經(jīng)母細胞瘤與擴增的MYCN基因表現(xiàn)為很高的缺失率或者變異率[4]。在細胞凋亡中,CDC2L1基因編碼的蛋白激酶能夠被caspase切割開和被修飾而發(fā)揮作用[5-11]。CDC2L1基因的幾個可選擇的剪接變體已經(jīng)被報告

4、。CDC2L1基因在維持細胞的細胞周期控制,凋亡,神經(jīng)生理學,分化和轉(zhuǎn)錄過程中具有重要的功能,通過抑制CDC2Ll基因活性來達到研究CDC2L1基因在瘢痕疙瘩形成中的作用已成為瘢痕疙瘩基因研究的熱點[12]。目前研究認為CDC2L1基因表達2種蛋白p58和p110,其中最重要的部分是p58蛋白,對CDC2L1基因發(fā)揮其功能是必不可少的,它也可以作為CDC2L1基因活性抑制劑的天然靶位[13]。靶向hCR常用的方法有RNA干擾(RNAi)

5、、反義核苷酸技術封閉、錘頭狀核酶切割等。其中小干擾RNA(siRNA)更是在哺乳動物細胞中顯示了強大的、有效的RNA干擾能力,因而化學合成的21-23核昔酸的siRNA或質(zhì)粒表達的小發(fā)夾RNA(shRNA)被常規(guī)用于基因沉默研究。科研人員利用脂質(zhì)體介導的細胞內(nèi)shRNA表達技術,該shRNAs在體內(nèi)再被加工為siRNAs,這種方式有可能導致有效的、長期的基因沉默。表達shRNA的質(zhì)粒載體J下被廣泛用于抗病毒、抗腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

6、脂質(zhì)體最常用于體外細胞的轉(zhuǎn)染,以后又被用做基因體內(nèi)導入的載體。脂質(zhì)體可以與DNA形成復合物,保護DNA不被核酸酶降解,與細胞膜結(jié)合后形成內(nèi)吞小體,把DNA釋放到細胞漿。脂質(zhì)體由脂質(zhì)雙分子層組成的封閉囊泡,無毒和無免疫原性,因此成為基因治療、RNAi分子遞送的重要工具,廣泛受到學者的青睞。
　　 國外研究CDC2L1基因時,所選的對象是腫瘤患者或?qū)嶒瀯游?沒有發(fā)現(xiàn)在瘢痕疙瘩方面的研究。所采取的研究方法多是RT-PCR,SNP分析,

7、基因芯片檢測技術,分子雜交技術,單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析,比較基因組雜交。國內(nèi)雖然有研究CDC2L1基因在瘢痕疙瘩中的作用,所采用的技術是比較基因組雜交技術(CGH),變性高效液相色譜法結(jié)合測序篩選和鑒定,但由于研究時涉及到多個基因的作用及相互作用,不能體現(xiàn)其中一個基因在瘢痕疙瘩中的作用。鑒于上述原因,本課題選擇利用基因治療策略及方法來研究單個相關基因(CDC2L1)在瘢痕疙瘩發(fā)病機制所起的作用及其意義。
　　 研究目的：
　　

8、 我們運用pGPU6/GFP/Neo siRNAExpression Vector構(gòu)建重組質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染來沉默瘢痕疙瘩成纖維細胞中的hCR基因表達,以觀察CDC2L1基因?qū)︸：鄹泶癯衫w維細胞生長的影響,為研究CDC2L1基因在瘢痕疙瘩中的作用提供可靠的依據(jù)和有效的手段。
　　 研究方法：
　　 1 CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纖維細胞中表達水平的測定
　　 通過q-PCR檢測瘢痕疙瘩成纖維細胞和人正常皮膚

9、成纖維細胞中CDC2L1基因的mRNA表達水平。
　　 2 RNAi重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建利用GenePharma公司的siRNA靶序列分析軟件設計siRNA靶序列,再根據(jù)siRNA設計原則,選擇針對hCR(GenBank number984)的21nt的序列(CDC2L1-1636,CDC2L1-1813,CDC2L1-1962位堿基)作為特異性siRNA靶序列?；瘜W合成62nt寡核苷酸和它的互補鏈,退火

10、、連接到BamH1/Bbs I線性化的pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pGPU6-hCR。插入序列采用Bbsl和Pstl酶切和測序的方法來證實。siRNA的陰性和陽性對照寡核營酸被用來構(gòu)建pGPU6-shNC,pGPU6-shhGAPDH,,構(gòu)建方法同hCR。該質(zhì)粒也用酶切和測序的方法證實。
　　 3篩選有效的干擾質(zhì)粒
　　 通過q-PCR檢測所構(gòu)建的重組質(zhì)粒對

11、CDC2L1基因的抑制效率,從而選擇干擾效果較好的重組質(zhì)粒為實驗的干擾靶點進行下游研究。
　　 4 RNAi重組質(zhì)粒沉默人瘢痕疙瘩成纖維細胞的hCR基因
　　 用RNAi重組質(zhì)粒和對照(pGPU6-shNC,pGPU6-shhGAPDH質(zhì)粒,脂質(zhì)體)轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細胞,同時設立對照。繪制生長曲線、Western blot法測定CDC2L1基因的蛋白變化,流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期。
　　 研究結(jié)果：

12、r>　　 1通過q-PCR檢測證明
　　 CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纖維細胞中mRNA的表達水平明顯升高,是人正常皮膚成纖維細胞中mRNA表達水平的38.85倍。
　　 2經(jīng)酶切和測序鑒定證明
　　 CDC2L1.shRNA模板成功插入到pGPU6表達質(zhì)粒中,成功構(gòu)建了3個shRNA表達質(zhì)粒。
　　 3通過q-PCR鑒定證明
　　 CDC2L1-1636干擾效率為67.33%,siRNA能夠有

13、效降低CDC2L1 mRNA水平,CDC2L1-1813和CDC2L1-1962抑制效率非常低,幾乎沒有抑制效率,從而選擇CDC2L1-1636為試驗的干擾靶點進行研究。
　　 4 MTT結(jié)果顯示
　　 GPU6-CDC2L1-shRNA-1636質(zhì)粒組較脂質(zhì)體組,pGPU6-shNC對照組和未轉(zhuǎn)染的空白細胞組生長速度有明顯差異,差異有統(tǒng)計學意(p＜0.05)。Western blot法測定CDC2L1基因的蛋白變化,流

14、式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期,與pGPU6-shNC質(zhì)粒對照組、pGPU6-shhGAPDH質(zhì)粒對照組、脂質(zhì)體對照組和空白對照組相比,pGPIJ6-CDC2L1-shRNA-1636質(zhì)粒組CDC2L1蛋白表達水平相應下降較明顯,細胞凋亡數(shù)目增加有明顯的差異,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 以上實驗結(jié)果表明,CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纖維細胞中mRNA的表達水平明顯升高,是人正常皮膚成纖維細胞中