小干擾RNA抑制CyclinD1表達誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的研究.pdf

1、一、研究背景及目的： 增生性瘢痕(Hypertrophicscar，HS)與瘢痕疙瘩(Keloid，K)是常見的病理性瘢痕，一般認為它們是由創(chuàng)傷引起，以成纖維細胞異常增殖，膠原等大量細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)的過度產(chǎn)生和沉積為特征的皮膚纖維增生性疾病，其發(fā)病率較高，尤其是瘢痕疙瘩，具有過度生長、超過原傷口界限、并侵犯臨近組織、始終不退化和單純手術切除后易復發(fā)等特點。 對于病理性瘢痕病因的

2、研究，至今國內外許多學者從組織學、病理學、生理學、免疫學和遺傳學等眾多方面開展了一些列的研究，提出了諸如膠原合成與降解失調、細胞因子促進、成纖維細胞凋亡障礙、免疫反應和遺傳學等許多學說，取得了不少成果，雖仍無法闡明病理性瘢痕的真正原因，但其中一點已經(jīng)明確，即無論是何種體內或體外因素的影響，最終結果都是造成病理性瘢痕成纖維細胞過度增殖，膠原過量沉積。這是所有病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩的病理特點。 我們針對人CyclinD1基因設計并合

3、成相應siRNA分子，轉染瘢痕疙瘩成纖維細胞下調CyclinD1mRNA，抑制CyclinD1的有效合成，同時應用多種方法觀測成纖維細胞異常增殖的抑制效果，為病理性瘢痕的RNAi治療研究提供初步的理論依據(jù)，也希望能為臨床進一步開展病理性瘢痕RNlAi治療提供新的思路。 二、材料和方法： 1.研究對象標本均取自南方醫(yī)院整形外科手術患者。增生性瘢痕標本77例，其中男56例，女21例，年齡4歲～45歲，瘢痕增生時間40d～5a

4、；瘢痕疙瘩標本10例，其中男6例，女4例，年齡18歲～46歲。24例正常皮膚(Normalskin，NS)均取自上述患者供皮區(qū)，為手術取皮修剪后殘余皮片。患者沒有長時間外用各種防治瘢痕藥物史，不伴有腫瘤及其它嚴重疾病。取材前向患者說明取材目的，并征得患者同意。瘢痕疙瘩標本病變部位分別為耳垂、三角肌區(qū)及前胸。直視下區(qū)分各標本中央部和周邊部，瘢痕組織中央較平且色淡區(qū)為中央部，周圍明顯隆起呈暗紅色區(qū)域為周邊部，均經(jīng)臨床及病理診斷證實。正常皮膚

5、均取自上述患者供皮區(qū)，為手術取皮修剪后殘余皮片。增生性瘢痕標本按瘢痕增生時間分為5組：1、1月～3月；2、4月～6月；3、7月～9月；4、10月～12月；5、12月以上。瘢痕疙瘩標本按中間2／3和周圍1／3部分分為中央部和周邊部2組。以NS組為對照。以PBS代替一抗作為陰性對照。 2.方法 (1)免疫組化染色檢測CyclinD1應用免疫組織化學SP法檢測CyclinD1在增生性瘢痕不同病理時期和瘢痕疙瘩不同部位成纖維細胞

6、中的表達差異。 (2)siRNA-cyclinD1分子的設計與合成應用ambion公司在線軟件siRNAtargetfinder設計siRNA-cyclinD1分子，其正義鏈為5’-CAAACAGAUCAUCCGCAAAtt，反義鏈為5’-UUUGCGGAUGAUCUGUUUGtt。siRNA-cyclinD1分子干擾CyclinD1基因的第664～684位核苷酸，靶序列為AACAAACAGATCATCCGCAAA。采用化學法分

7、別合成siRNA-cyclinD1分子的正義鏈和反義鏈，經(jīng)過變性退火處理后得到雙鏈siRNA-cyclinD1分子。 (3)實驗分組及轉染siRNA-cyclinD1分子。 轉染實驗分2組：無關siRNA轉染組，siRNA-cyclinD1轉染組。設立未處理細胞為對照組。每組實驗重復3次。 (4)RT-PCR法檢測CyclinD1基因表達成纖維細胞經(jīng)siRNA-cyclinD1轉染24h、48h、72h后分別提取

8、細胞總RNA，然后進行逆轉錄反應，檢測CyclinD1基因的mRNA相對表達量的改變。 (5)雙標記流式細胞術分析細胞凋亡成纖維細胞經(jīng)siRNA-cyclinD1轉染24h、48h、72h后，分別收集106個細胞進行流式細胞術檢測，經(jīng)Cellquest軟件分析4個區(qū)域(UL，UR，LL，LR)內的細胞百分數(shù)。UR和LR區(qū)域的細胞百分數(shù)代表了凋亡細胞百分比。 (6)細胞凋亡DNA片段檢測成纖維細胞轉染24h、48h、72h

9、后，分別收集siRNA-cyclinD1轉染組(實驗組)和無關siRNA轉染組(對照組)細胞各1×105個，提取DNA后進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳。 (7)MTT法檢測成纖維細胞活性siRNA-cyclinD1轉染成纖維細胞24h，48h，72h后，MTT法檢測成纖維細胞活性，以轉染無關siRNA的細胞為對照組。計算各個時間點細胞增殖抑制率，計算公式為：細胞增殖抑制率=(1-轉染siRNA-cyclinD1后的A570值／對照組

10、細胞A570值)×100％。各時間點實驗重復3次。 (8)數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，進行非參數(shù)檢驗--多組獨立樣本秩和檢驗(Kruskal-WallisH檢驗)、單因素方差分析和以及LsD法進行組間多重比較。 三、結果： (1)增生性瘢痕不同時期成纖維細胞CyclinD1的表達在增生性瘢痕早期，CyclinD1陽性表達的成纖維細胞較多，中晚期陽性表達的成纖維細胞明顯減少，部分標本成纖維細胞中C

11、yclinD1表達陰性。表達隨增生性瘢痕的發(fā)展明顯呈現(xiàn)由強至弱的變化。統(tǒng)計學處理顯示：不同時期增生瘢痕和正常皮膚成纖維細胞中CyclinD1的表達差別有統(tǒng)計學意義(X2=68.53，P<0.001)。兩兩比較結果：第四和第五組差異無統(tǒng)計學意義，其他各組兩兩比較均差異有統(tǒng)計學意義。 (2)瘢痕疙瘩不同部位成纖維細胞CyclinD1的表達瘢痕疙瘩周邊部，CyclinD1陽性表達高，而在中央部，陽性表達明顯減少。統(tǒng)計學處理顯示：邊緣部

12、與NS組比較、邊緣部與中央部比較以及中央部與NS組比較，CyclinD1蛋白表達均有顯著性差異(P<0.001)。 (3)轉染后成纖維細胞形態(tài)的變化： 轉染特異性小干擾性RNA的24h后部分成纖維細胞從梭形轉變?yōu)閳A形或橢圓形，并且隨著時間增加，圓形或橢圓形細胞所占的比例逐漸增加，而未處理組和轉染空脂質體組72h后細胞形態(tài)基本相同。 (4)轉染siRNA-cyclinD1后對CyclinD1基因mRNA水平的影響成

13、纖維細胞轉染50nMsiRNA-cyclinD1后，成纖維細胞的CyclinD1基因相對表達量在24h-72h內逐漸減少。 (5)siRNA-cyclinD1轉染后對成纖維細胞周期的影響 成纖維細胞轉染特異性siRNA-cyclinD1分子24h、48h、72h后，重復3次實驗并采用SPSS12.0軟件對結果進行單因素方差分析顯示： (1)siRNA-cyclinD1轉染影響各組細胞的G0／G1期(F=22.18

14、，P<0.001)； (2)siRNA-cyclinD1轉染影響各組細胞的S期(F=29.88，P<0.001)； (3)siRNA-cyclinD1轉染不影響各組細胞的G2／M期(F=2.77，P=0.11)。 (4)siRNA-cyclinD1轉染成纖維細胞后誘導細胞凋亡情況特異性siRNA-eyclinD1分子轉染成纖維細胞24h、48h、72h后，重復3次實驗得到的細胞周期結果并進行單因素方差分析，結果：

15、siRNA-cyClinD1轉染影響各組細胞的凋亡率(F=458.77，P<0.001)。 (5)siRNA-cyclinD1轉染后細胞DNA片段化成纖維細胞轉染特異性siRNA-cyclinD1后，24h內未見DNA小片段，48h~72h內出現(xiàn)大小介于100~400bp之間的DNA小片段。 (6)siRNA-cyclinD1轉染后成纖維細胞后的細胞增殖情況成纖維細胞轉染siRNA-cyclinD1后的24h、48h、7

16、2h，應用MTT法測定細胞生長情況(A570)，重復3次實驗并采用SPSS12.0軟件進行單因素方差分析，結果為：siRNA-cyclinD1轉染24、48、72h各個時間點內均影響各組細胞增殖(P值均<0.001)。 結果為： (1)與無關siRNA轉染組相比，siRNA-cyclinD1轉染組細胞生長受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)； (2)與未處理組相比，siRNA-cyclinD1轉染組細胞生

17、長受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)； (3)與未處理組相比，無關siRNA轉染組細胞生長差異無統(tǒng)計學意義(P=0.854)。 四、結論： 1.CyclinD1在病理性瘢痕的形成中起著重要作用，通過縮短G1期進程導致成纖維細胞異常增殖而促進了病理性瘢痕的形成。 2.CyclinD1在增生性瘢痕早期成纖維細胞中的高表達與增生性瘢痕早期增生旺盛密切相關。 3.CyclinD1在瘢痕疙瘩周邊部