過表達(dá)sortilin促進(jìn)神經(jīng)生長因子前體誘導(dǎo)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡及作用機(jī)制.pdf

1、瘢痕疙瘩屬于病理性瘢痕，其特點(diǎn)是過度的皮膚纖維化和異常愈合的傷口瘢痕。具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前尚無安全有效的治療方法。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）也稱為神經(jīng)營養(yǎng)因子，機(jī)體首先分泌合成神經(jīng)生長因子前體(proNGF)，然后由蛋白酶分解為成熟的神經(jīng)生長因子。NGF和proNGF在與高親和力酪氨酸激酶受體(TrkA)和低親和力受體(p75NTR)進(jìn)行結(jié)合的基礎(chǔ)上來調(diào)控細(xì)胞的生死;在激活不同受體的情況下神經(jīng)生

2、長因子能夠發(fā)揮完全相反的生物作用，在與受體p75NTR結(jié)合時可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，相反與高親和力受體TrkA結(jié)合時則可以激活NF-kB通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。proNGF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力明顯強(qiáng)于NGF，proNGF與p75的結(jié)合力明顯高于其與TrkA的結(jié)合力，proNGF是以形成proNGF-p75-sortilin配體受體復(fù)合物，激活信號傳導(dǎo)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其中在神經(jīng)生長因子前體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中Sortilin發(fā)揮了“開關(guān)作

3、用”，控制P75NTR發(fā)揮關(guān)鍵作用，在本課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)，瘢痕成纖維細(xì)胞中輔助受體Sortilin的表達(dá)水平較正常皮膚成纖維細(xì)胞明顯下降，其可能與瘢痕的成纖維細(xì)胞過度增殖有關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。
　　瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KFs)過度增殖與proNGF（神經(jīng)生長因子前體）有密切關(guān)系，但具體機(jī)制尚不清楚，并且proNGF受體在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常人皮膚成纖維細(xì)胞(NFs)中的表達(dá)是否存在差異，因此，在本研究中，我們對

4、比觀察Sortilin及p75在KFs和NFs中的表達(dá)差異，并通過基因工程技術(shù)過表達(dá)Sortilin，檢測proNGF誘導(dǎo)KFs-Sortilin細(xì)胞凋亡的影響并探索相關(guān)機(jī)制。
　　第一部分 Sortilin在人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)差異
　　目的：
　　研究Sortilin在KFs和NFs中的表達(dá)差異，分析尋找瘢痕疙瘩疾病的發(fā)病機(jī)制，為瘢痕疙瘩的徹底有效治療提供理論支持。
　　方法：

5、r>　　收集正常人皮膚組織8例，瘢痕疙瘩8例，分別按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計分組培養(yǎng)KFs和NFs。采用Real-Time PCR(實(shí)時熒光定量PCR)和蛋白免疫印跡(Western Blot)方法檢測不同細(xì)胞中sortilin表達(dá)量的差異，同時利用流式細(xì)胞術(shù)及Caspase-3檢測分析細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　Real-Time PCR及Western Blot檢測顯示在mRNA水平和蛋白水平上Sortilin在KFs和NFs中均

6、呈陽性表達(dá)，但是Sortilin在KFs中表達(dá)量較NFs中表達(dá)量顯著降低，p＜0.05，其差別有統(tǒng)計學(xué)意義。而p75在KFs和NFs中的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　Sortilin在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中表達(dá)明顯減少，可能與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞過度增殖有關(guān)。
　　第二部分 過表達(dá)Sortilin促進(jìn)proNGF誘導(dǎo)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡
　　目的：
　　研究Sortilin在神經(jīng)生長因子前體(proN

7、GF)誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡中的影響，并分析其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及作用機(jī)制，為臨床上對瘢痕疙瘩的干預(yù)治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　我們以KFs和NFs為研究對象。通過基因工程方法構(gòu)建過表達(dá)Sortilin質(zhì)粒，并通過慢病毒轉(zhuǎn)染培育過表達(dá)Sortilin的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，然后利用流式細(xì)胞術(shù)及Caspase-3分析檢測各組細(xì)胞凋亡情況;最后通過免疫蛋白印跡分析其凋亡信號蛋白表達(dá)情況，以明確其誘導(dǎo)凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

8、>　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建過表達(dá)Sortilin質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后成功培育篩選出過表達(dá)Sortilin的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KFs-Sortilin)的穩(wěn)定細(xì)胞株，KFs-Sortilin凋亡顯著增強(qiáng)，并且在有proNGF存在是KFs-Sortilin細(xì)胞凋亡更加顯著，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過免疫蛋白印跡方法分析Sortilin參與凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑，結(jié)果顯示PI3K/Akt/NF-κB信號通路蛋白表達(dá)明顯降低，Bax蛋白的表達(dá)明顯

9、增加，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　過表達(dá)Sortilin明顯促進(jìn)proNGF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑是通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路，并且Bax的表達(dá)增加?？傊?，我們的研究表明，通過基因工程技術(shù)過表達(dá)Sortilin后，proNGF誘導(dǎo)的KFs細(xì)胞凋亡顯著增強(qiáng)，其具體機(jī)制可能是通過增加Bax的表達(dá)，抑制PI3K/Akt激活NF-κB信號通路，總之我們通過本實(shí)驗(yàn)研究成功培育出過表達(dá)Sortili