生物篩選轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1噬菌體模擬肽及其抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 創(chuàng)傷愈合是一個(gè)修復(fù)組織完整性的多相過(guò)程。包含了多種細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子之間的機(jī)能協(xié)調(diào)及相互作用。異常的創(chuàng)傷愈合過(guò)程，如：燒傷，挫傷和外科手術(shù)導(dǎo)致的不規(guī)則的皮膚創(chuàng)傷愈合，會(huì)導(dǎo)致瘢痕疙瘩盼發(fā)生。瘢痕疙瘩不僅影響患者的軀體功能，常導(dǎo)致焦慮等心理問(wèn)題。臨床治療治療后復(fù)發(fā)率高，對(duì)于整形外科醫(yī)生，是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。
　　 目前，關(guān)于瘢痕疙瘩的研究集中在細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子和基因治療等方面。轉(zhuǎn)化生

2、長(zhǎng)因子-β1(Transformating growth factor-betal，TGF-β1)是一種多功能的生長(zhǎng)因子，與創(chuàng)面愈合和瘢痕形成密切相關(guān)。核因子κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)和TGF-βreceptorⅡ(TβRⅡ)是TGF-β1信號(hào)的重要的細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)。TGF-β1通過(guò)這些通路調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖

3、。阻斷TGF-β1的信號(hào)通路是一種有效防治瘢痕疙瘩的方法。
　　 噬菌體肽庫(kù)(Peptide library)技術(shù)是噬菌體展示技術(shù)的一個(gè)非常重要的分支。其原理是通過(guò)把大量的隨機(jī)肽段與絲狀噬菌體的外殼蛋白(PⅧ或PⅢ)融合表達(dá)、組裝，從而展示于噬菌體顆粒表面以組成每個(gè)噬菌體都帶有一個(gè)不同肽段的重組噬菌體庫(kù)，然后用目的蛋白來(lái)篩選與之相互作用的噬菌體肽。通過(guò)分析所篩選到的噬菌體肽的結(jié)構(gòu)和序列，為蛋白質(zhì)分子之間(如抗原與抗體、受體和配體

4、、酶與底物)的相互作用機(jī)理提供理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)支持。噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)日益受到人們的重視，噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)也日趨成熟，并根據(jù)應(yīng)用目的不同而構(gòu)建了各種不同的肽庫(kù)，其已成為探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋求高親合力生物活性的配體分子、探測(cè)未知蛋白空間結(jié)構(gòu)表位的工具，在蛋白分子相互識(shí)別的研究、新型疫苗的研制以及藥物的開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。已從噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)中篩選獲得多種生長(zhǎng)因子的特異性的配體和抗原表位，如CTGF，EGF，F(xiàn)GF和V

5、EGF等。
　　 本研究的目的是從噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)中篩選獲得TGF-β1噬菌體模擬肽。噬菌體上表達(dá)的特異性的模擬肽可能包含類似于TGF-β1的外源性多肽，可能是TGF-β1的受體阻斷劑，與TGF-β1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合其受體，從而抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖。應(yīng)用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)篩選獲得TGF-β1的肽抑制劑，有助于抑制TGF-β1的作用，可能為防治瘢痕疙瘩提供新的機(jī)遇。
　　 材料和方法:
　　 第一部分應(yīng)用噬菌體隨機(jī)

6、十二肽庫(kù)篩選TGF-β1相關(guān)模擬肽的實(shí)驗(yàn)研究
　　 以人TGF-β1單克隆抗體為靶，進(jìn)行4輪生物淘選，富集包含特異性模擬肽的噬菌體。對(duì)洗脫物和擴(kuò)增物進(jìn)行滴度測(cè)定。宿主菌劃線接種、培養(yǎng)進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增。接種宿主菌單菌落于培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)藍(lán)斑，計(jì)算噬菌體滴度。隨機(jī)挑選第4輪生物淘選的噬菌體藍(lán)斑，擴(kuò)增后計(jì)算噬菌體產(chǎn)出/投入比，評(píng)估噬菌體的回收率。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)單克隆噬菌體的結(jié)合力，將噬菌體DNA沉淀、離心，進(jìn)行瓊脂糖

7、凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。噬菌體DNA和-96gⅢ測(cè)序引物一起送北京華大基因有限公司，進(jìn)行染料示蹤的雙脫氧法自動(dòng)測(cè)序。應(yīng)用核酸Blast系統(tǒng)檢測(cè)模擬肽DNA的相似性。
　　 第二部分 TGF-β1噬菌體模擬肽抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究
　　 以人TGF-β1單克隆抗體包被孔板，加肽庫(kù)，共篩選4輪，富集包含特異性模擬肽的噬菌體。由北京華大基因有限公司進(jìn)行染料示蹤的雙脫氧法自動(dòng)測(cè)序。應(yīng)用核酸相似性比較數(shù)據(jù)庫(kù)(Bl

8、ast系統(tǒng))檢測(cè)模擬肽DNA的相似性。共獲得4個(gè)噬菌體模擬肽，進(jìn)行下一步的離體試驗(yàn)。
　　 從經(jīng)過(guò)病理學(xué)鑒定的瘢痕疙瘩培養(yǎng)獲得瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞。應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法獲得瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞。
　　 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量，檢測(cè)TGF-β1對(duì)細(xì)胞增殖的影響。共設(shè)13組：包括陰性對(duì)照組、噬菌體M13對(duì)照組、TGF-β1對(duì)照組各1組和噬菌體模擬肽組10組。
　　 應(yīng)用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑

9、盒和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。共設(shè)5組：陰性對(duì)照組和4組噬菌體模擬肽組。Annexin V-FITC陽(yáng)性和PI陰性表示細(xì)胞處于凋亡早期階段，二者均為陽(yáng)性表示細(xì)胞處于凋亡晚期階段，二者均陰性為未凋亡細(xì)胞。
　　 模擬肽的細(xì)胞親和力檢測(cè)：共設(shè)13組：包括陰性對(duì)照組、噬菌體M13對(duì)照組(1012 pfu/ml)、TGF-β1對(duì)照組(5 mg/L)各1組和噬菌體模擬肽組10組(1012pfu/ml)。按照免疫熒光檢測(cè)試劑盒的操作指導(dǎo)說(shuō)

10、明進(jìn)行操作。以人單克隆TGF-β1抗體(紅色)和M13外殼蛋白(綠色)為一抗。
　　 采用實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞核因子κB(NF-κB)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。共設(shè)13組：包括陰性對(duì)照組、噬菌體M13對(duì)照組、TGF-μ1對(duì)照組各1組和噬菌體模擬肽組10組。應(yīng)用RNAiso試劑提取表皮細(xì)胞的總RNA。應(yīng)用PrimeScriptTM RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，應(yīng)用SYBR Premix Ex

11、TaqTMⅡ進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：30 s，95℃；95℃5s，58℃31 s(40個(gè)循環(huán))。引物序列為：(1)β-肌動(dòng)蛋白：上游：5’TGACGTGGACATCCGCAAAG3’，下游：5’CTGGAAGGTGGACAGCGAGG3’(204 bp)；(2)NF-κB：上游：5’CTGTAACTGCTGGACCCAAGG3’，下游：5’CTTTTTCCCGATCTCCCAGCT3’(209 bp)；(3)CTGF：上游：5’CC

12、TCTTCTGTGACTTCGGCTC3’，下游：5’GAACGTCCATGCTGCACAG3’(188 bp)。
　　 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用單因素方差分析法(one-way ANOVA)和Dunnet's檢測(cè)方法分析各組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1，應(yīng)用噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)篩選TGF-β1相關(guān)模擬肽的實(shí)驗(yàn)研究
　　 經(jīng)過(guò)

13、4輪生物淘選，獲得的噬菌體總量及其產(chǎn)率均逐漸升高，包含有特異性模擬肽的噬菌體獲得了富集，ELISA檢測(cè)獲得TGF-β1的標(biāo)準(zhǔn)品-吸光度值的曲線。結(jié)果顯示篩選獲得的噬菌體具有較好的結(jié)合活性，測(cè)序獲得10個(gè)與促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖或抑制細(xì)胞增殖有關(guān)的堿基序列。經(jīng)過(guò)Blast系統(tǒng)檢測(cè)，其中1個(gè)模擬肽(No.1)與TGF-β1相似，3個(gè)模擬肽(No.2，5，8)與TGF-β2相似，5個(gè)模擬肽(No.3，6～8，10)與TβRⅡⅠ受體相似，3個(gè)模擬肽

14、(No.4，5，8)與TGF-β誘導(dǎo)因子相似，1個(gè)模擬肽(No.9)與NF-κB相似，6個(gè)模擬肽(No.4～9)與細(xì)胞分裂原素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)相似。
　　 2，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1噬菌體模擬肽抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究
　　 在570 nm處檢測(cè)吸光度A值，MTT結(jié)果顯示陰性對(duì)照組的A值為0.22(保留小數(shù)點(diǎn)后兩位數(shù)字M13對(duì)照組也是0.2

15、2)，TGF-β1對(duì)照組不同濃度(0.05、0.5、5μg/L)的A值分別為0.29、0.31、0.35，單因素方差分析和Dunnet's方法分析結(jié)果顯示TGF-β1對(duì)照組與陰性對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TGF-β1對(duì)照組能夠顯著地促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖(P<0.01)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示在陰性對(duì)照組和噬菌體M13對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在陰性對(duì)照組和第5、6組噬菌體模擬肽組之間，以及陰性對(duì)照組和低濃度(1010

16、pfu/ml)的第7、10組噬菌體模擬肽組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是陰性對(duì)照組和其他噬菌體模擬肽組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果提示4種噬菌體模擬肽(第7～10組)能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖。
　　 對(duì)MTT結(jié)果中能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的4種噬菌體模擬肽(第7～10組)，進(jìn)一步評(píng)估其促使瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的作用。相對(duì)于陰性對(duì)照組，這4種噬菌體模擬肽(第7～10組)能夠輕度促使瘢痕疙瘩凋

17、亡，能夠誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的晚期階段。
　　 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示TGF-β1對(duì)照組和10種噬菌體模擬肽組能夠與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞相結(jié)合，但是噬菌體M13對(duì)照組不能與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞相
　　 結(jié)果:
　　 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TGF-β1對(duì)照組和各噬菌體模擬肽組(1～10組)NF-κB及CTGF的表達(dá)水平，與陰性對(duì)照組(表達(dá)量設(shè)為1)相比，TGF-β1對(duì)照組和第1～4噬菌體模擬肽組NF-κB和CTGF

18、的表達(dá)升高，第5～6噬菌體模擬肽組變化不明顯，而第7～10噬菌體模擬肽組表達(dá)減弱。其中NF-κB的表達(dá)量分別是陰性對(duì)照組的0.28、0.26、0.46、0.30倍，CTGF的表達(dá)量分別是陰性對(duì)照組的0.26、0.60、0.34、0.17倍。
　　 結(jié)論:
　　 1，從噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)中可淘選到與TGF-β1相關(guān)的噬菌體模擬肽。
　　 2，4種噬菌體模擬肽能夠與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞相結(jié)合，并輕度促使瘢痕疙瘩成纖維細(xì)