脂聯(lián)素對結締組織生長因子介導的瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移和細胞外基質產(chǎn)生的調控機制研究.pdf

1、目的:瘢痕疙瘩是遺傳素質的個體皮膚創(chuàng)傷愈合的過程中，瘢痕疙瘩成纖維細胞(keloid fibroblasts，KFs)異常增殖，Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)等細胞外基質(extracellular matrix, ECM)過度沉積導致的纖維過度增生性疾病。瘢痕疙瘩的發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)有的研究表明各種細胞因子、生長因子，比如轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)

2、、血管內皮細胞生長因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGF)和血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等在瘢痕疙瘩發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用，而細胞因子和生長因子的作用和意義也越來越受到國內外研究者們的重視。
　　結締組織生長因子(connective

3、tissue growth factor, CTGF)是目前研究得較多的一種細胞因子，CTGF屬于CCN家族成員，廣泛表達于體內多種組織和器官，在瘢痕疙瘩組織中可被誘導而高度表達，并作為TGF-β的下游效應因子或者不依賴于TGF-β而單獨作用，從而刺激成纖維細胞的活化、增殖和遷移，并促進ECM的過度累積，是瘢痕疙瘩增殖的必要因素及維持瘢痕疙瘩纖維化的關鍵生長因子。由于CTGF的生物學效應單一，因此，阻斷CTGF的表達或者抑制其活性將可能

4、成為治療瘢痕疙瘩的有效方法。
　　脂聯(lián)素是一種由脂肪細胞分泌的新型脂肪因子，廣泛表達于人體的各種組織和器官，在外周血中濃度較高。目前已研究證實人體內存在四個脂聯(lián)素的受體(adiponectin receptors, adipoRs)，即adipoR1、adipoR2、T-鈣黏蛋白(T-cadherin)和鈣網(wǎng)織蛋白(calreticulin)，脂聯(lián)素通過與其受體adipoRs結合后，活化腺苷酸活化的蛋白激酶(Adenosine5'

5、-monophosphate activated protein kinase，AMPK)、絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl-inositol3-kinase，PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(serine threonineprotein kinase，Akt)等多種信號通路，在調節(jié)高血壓、糖尿病、高血脂和動脈粥樣硬化等肥胖

6、相關的代謝性疾病過程中發(fā)揮重要的作用。此外，脂聯(lián)素可以作為負性調控因子，發(fā)揮調節(jié)免疫、抑制細胞增殖、遷移和炎癥反應、誘導細胞凋亡的作用。
　　目前關于脂聯(lián)素在瘢痕疙瘩的相關研究尚未見報導，然而最近研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可抑制多種組織器官及皮膚組織的纖維化進程，由于炎癥反應、細胞增殖和遷移增加及凋亡下降是瘢痕疙瘩致病的重要病理基礎，而皮膚組織纖維化是瘢痕疙瘩疾病進程的重要特征之一，因此，脂聯(lián)素可能在瘢痕疙瘩的發(fā)病過程中發(fā)揮一定的作用。

7、>　　本研究旨在通過研究脂聯(lián)素對CTGF誘導的KFs增殖、遷移和ECM產(chǎn)生的影響及其作用機制，探討脂聯(lián)素在瘢痕疙瘩發(fā)病過程中的可能作用。
　　方法:臨床收集瘢痕疙瘩患者和正常健康對照者的皮膚組織，采用組織塊貼塊法原代離體培養(yǎng)KFs和正常皮膚成纖維細胞(normal dermal fibroblasts，NFs)，用波形蛋白vimentin和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)對培養(yǎng)的成纖維細

8、胞進行鑒定，選取3～5代細胞進行后續(xù)的實驗。
　　采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)、實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，real-time PCR)、蛋白質免疫印跡(western blot)和細胞免疫熒光的方法檢測KFs中脂聯(lián)素及adipoRs的表達，并以NFs作對

9、照。收集的瘢痕疙瘩和正常皮膚組織制備成石蠟切片，觀察瘢痕疙瘩和正常皮膚組織形態(tài)結構的差別，并以組織免疫組化法檢測兩種組織中adipoRs的表達及分布。
　　以不同濃度CTGF(0、2 ng/ml、4 ng/ml、6 ng/ml、8 ng/ml和12 ng/ml)和時間點(0 h、2h、6h、12h、24 h、48 h)刺激KFs、NFs，采用細胞計數(shù)試劑盒-8(CellCounting Kit-8，CCK-8)檢測KFs、NFs的

10、細胞活性，選擇CTGF的最佳作用濃度和時間。以外源性CTGF刺激KFs、NFs24 h，采用CCK-8的方法檢測細胞增殖、Transwell檢測細胞遷移，觀察脂聯(lián)素對CTGF刺激的KFs和NFs細胞增殖和遷移作用的影響;以real-time PCR和western blot的方法檢測脂聯(lián)素對CTGF刺激的KFs和NFs中Ⅰ型膠原、FN及α-SMA的基因和蛋白表達水平的影響。
　　采用RNA干擾(RNA interference，R

11、NAi)技術，誘導adipoRs基因沉默，并加入外源性CTGF和脂聯(lián)素刺激KFs24 h，以CCK-8檢測細胞增殖，Transwell檢測細胞遷移，real-time PCR檢測Ⅰ型膠原、FN及α-SMA的基因表達水平。
　　外源性CTGF和脂聯(lián)素刺激KFs24 h，western blot檢測AMPK、MAPK和PI3K-Akt通路的磷酸化水平;在此基礎上，加入AMPK、p-38MAPK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-

12、terminal kinase，JNK)、細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(Extracellularsignaling regulatory protein kinase，ERK)和Akt的通路阻滯劑，CCK-8檢測細胞增殖、Transwell檢測細胞遷移，real-time PCR檢測Ⅰ型膠原、FN及α-SMA基因的表達水平。
　　結果:瘢痕疙瘩組織表皮厚度顯著高于正常皮膚組織，并有較多的炎性細胞浸潤和大量的膠原纖維。vimentin和

13、α-SMA免疫染色證實所培養(yǎng)的是成纖維細胞。與正常皮膚組織相比，脂聯(lián)素及其四個受體adipoR1、adipoR2、T-cadherin和calreticulin從組織水平、細胞水平、蛋白及基因水平在瘢痕疙瘩中的表達均明顯下降。
　　外源性CTGF可呈時間和濃度依賴方式促進KFs增殖，在6 ng/ml和24 h時達峰值，這一作用能被脂聯(lián)素所抑制，在5tg/ml時作用最明顯;同樣，脂聯(lián)素能夠抑制CTGF誘導的KFs遷移和KFs中Ⅰ型膠

14、原、FN及α-SMA的基因和蛋白水平的表達，而對NFs的作用不明顯。
　　脂聯(lián)素抑制CTGF刺激的KFs中APMK、p-38MAPK和ERK的通路磷酸化，而對JNK和Akt的磷酸化無明顯影響;脂聯(lián)素抑制CTGF誘導的KFs增殖、遷移和ECM的累積作用能被Compound C(APMK通路阻斷劑)、SB203580(p-38MAPK通路阻斷劑)和PD98059(ERK通路阻斷劑)和小干擾RNA(small interfering R