撤除生長因子對(duì)hUCMSCs增殖和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)具有多向分化潛能和自我更新能力,其誘導(dǎo)植入有望成為應(yīng)用廣泛的細(xì)胞治療手段。為了快速獲得足夠數(shù)量的hUCMSCs,研究人員常在培養(yǎng)基中添加生長因子以促進(jìn)細(xì)胞生長。但是當(dāng)hUCMSCs輸入人體后,沒有添加的生長因子的繼續(xù)作用,細(xì)胞的增殖、遷移及定植能力是否會(huì)受到影響呢?細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞的增殖、遷移

2、及定植能力密切相關(guān),因此本實(shí)驗(yàn)研究了細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)情況。
　　 本研究的目的是:1.研究完全撤除表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)對(duì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響。2.保留半量的EG

3、F、bFGF、VEGF是否可以維持細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)。
　　 方法:
　　 1.hUCMSCs的分離培養(yǎng)及表型鑒定臍帶在采集后6h內(nèi)用植塊法分離培養(yǎng),每3～4d換液1次,達(dá)到80％融合時(shí)以細(xì)胞密度5×104個(gè)/cm2傳代培養(yǎng),取第5代穩(wěn)定生長的hUCMSCs用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型鑒定。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組取第5代hUCMSCs,細(xì)胞生長達(dá)70％融合時(shí)為細(xì)胞換液撤除因子,并將細(xì)胞分為三組:對(duì)照組,生長因子濃度

4、同前;實(shí)驗(yàn)組1,將生長因子濃度突然減半;實(shí)驗(yàn)組2,所換培養(yǎng)基不添加任何生長因子,僅含正常濃度的血清。
　　 3.瑞氏-姬姆薩法染色觀察細(xì)胞形態(tài):將第5代hUCMSCs接種至24孔板,細(xì)胞生長達(dá)70％融合時(shí)按分組為細(xì)胞換液,繼續(xù)培養(yǎng)30小時(shí)后行瑞氏.姬姆薩法染色觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 4.MTT法細(xì)胞計(jì)數(shù):按分組將第5代hUCMSCs種植于96孔板,每孔加入5×103個(gè)細(xì)胞(200μL),在37℃、5％CO2條件下孵育30小

5、時(shí)后進(jìn)行MTT法計(jì)數(shù)。
　　 5.實(shí)時(shí)定量PCR(real-time Q-PCR)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及胞外基質(zhì)基因的表達(dá)。
　　 5.1 Trizol法提取總RNA將細(xì)胞接種至6孔板,細(xì)胞生長達(dá)70％融合時(shí)為細(xì)胞換液,分上述3組,繼續(xù)培養(yǎng)15小時(shí)后吸出培養(yǎng)液,每孔加入Trizol1ml,提取總RNA。
　　 5.2紫外分光光度法測(cè)所提取總RNA濃度,按說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。
　　 5.3實(shí)時(shí)定量

6、PCR檢測(cè)膠原蛋白-Ⅰ(Collagen-Ⅰ,Col-Ⅰ),膠原蛋白-Ⅳ(Collagen-Ⅳ,Col-Ⅳ),纖連蛋白(Fibronectin,FN),層粘連蛋白(Laminin,LN),整合素(Integrin),粘膠蛋白(Tenascin-C),基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MatrixMetalloprotease-2,MMP-2),基質(zhì)金屬蛋白酶-7(Matrix Metalloprotease-7,MMP-7),基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Ma

7、trix Metalloprotease-9,MMP-9),BCL-2,BAX基因的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞表形檢測(cè)結(jié)果
　　 所獲得的貼壁細(xì)胞CD34和CD45陰性表達(dá),CD44、CD105、CD71、CD90陽性表達(dá),符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。
　　 2.hUCMSCs的形態(tài)學(xué)觀察
　　 2.1對(duì)照組:細(xì)胞扁平或長梭形,可見突起,胞核較大,扁卵圓形,染色質(zhì)細(xì)小稀疏著色淺,核仁明顯

8、,胞質(zhì)較豐富,呈弱嗜堿性,可見嗜堿性顆粒。
　　 2.2實(shí)驗(yàn)組1:細(xì)胞扁平或長梭形,部分細(xì)胞較對(duì)照組變大、變圓,核質(zhì)比減小。
　　 2.3實(shí)驗(yàn)組2:多數(shù)細(xì)胞較對(duì)照組變大、變圓,核質(zhì)比減小。
　　 3.MTT法細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果
　　 與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組2細(xì)胞數(shù)目減少,但不具顯著差異(P=0.16);實(shí)驗(yàn)組1細(xì)胞數(shù)目略有增加,亦不具顯著差異(P=0.49)。
　　 4.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果
　　

9、4.1凋亡相關(guān)基因BCL-2和BAX表達(dá)情況撤除生長因子后BCL-2表達(dá)上調(diào),BAX表達(dá)下調(diào),BCL-2/BAX比率增大,實(shí)驗(yàn)組1較實(shí)驗(yàn)組2BCL-2表達(dá)上調(diào)、BAX表達(dá)下調(diào)幅度更大,BCL-2/BAX比率更高。
　　 4.2胞外基質(zhì)基因表達(dá)情況與對(duì)照組相比,半量撤除因子時(shí),Col-Ⅰ、FN、LN、Integrin和Tenascin-C表達(dá)增高,完全撤除時(shí)Col-Ⅰ、FN表達(dá)增高,LN、Integrin和Tenascin-C表達(dá)

10、下調(diào)。而Col-Ⅳ、MMP-2、MMP-7和MMP-9半量撤除和完全撤除時(shí)均減少,完全撤除時(shí)減少更多。
　　 結(jié)論:
　　 1.撤除EGF、VEGF、bFGF會(huì)降低hUCMSCs的增殖能力,保留半量生長因子可以維持hUCMSCs的增殖能力。
　　 2.撤除因子可導(dǎo)致細(xì)胞體積變大,核質(zhì)比減小。
　　 3.撤除因子后,BCL-2/BAX比率增大,細(xì)胞的抗凋亡能力增強(qiáng),半量撤除時(shí)細(xì)胞的抗凋亡能力較完全撤除時(shí)更強(qiáng)