miR-455對(duì)高糖誘導(dǎo)下人腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響.pdf

1、糖尿病是21世紀(jì)最嚴(yán)重的公共健康挑戰(zhàn)之一。2014年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟估計(jì)全球至少有3.87億糖尿病患者，到2035年這個(gè)數(shù)字預(yù)計(jì)會(huì)攀升至約6億，這意味著世界上每十個(gè)成年人中就將有一個(gè)糖尿病患者。糖尿病腎臟病(diabetickidney disease，DKD)是糖尿病的常見并發(fā)癥之一和導(dǎo)致終末期腎病(end-stagerenal disease，ESRD)的主要原因。無論是在1型糖尿病還是2型糖尿病中，DKD的發(fā)生都與血糖控制不佳有關(guān)。

2、高血糖通過非酶途徑產(chǎn)生的晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGE)的積聚、蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)和多元醇通路的激活、氧化應(yīng)激的增強(qiáng)、血管活性物質(zhì)及細(xì)胞因子的激活，激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的作用等因素引起組織損傷，各因素之間又相互影響。在高糖狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cells，MCs)功能紊亂，引起細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular mat

3、rix，ECM)蛋白合成和降解相對(duì)失衡而大量堆積于系膜區(qū)及基底膜區(qū)，使腎小球形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生病理性變化，最終導(dǎo)致腎小球硬化癥的發(fā)生。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是一個(gè)龐大的小分子調(diào)控RNA家族，是約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的內(nèi)源性非編碼RNA，其可與靶基因mRNA3'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(3'-untranslated region，3'UTR)結(jié)合，通過促進(jìn)mRNA降解或阻斷蛋白翻譯來調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)從而調(diào)控機(jī)體病理生理過

4、程。miRNA在細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化及凋亡中發(fā)揮重要作用。miRNA在不同的組織表達(dá)不同，且其表達(dá)的變化參與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如糖尿病、腎臟疾病、腫瘤和心血管疾病等。越來越多的證據(jù)表明miRNA在與DKD病理改變相關(guān)的信號(hào)通路中起到調(diào)節(jié)作用。例如，miR-192可激活TGFβ信號(hào)通路導(dǎo)致腎臟纖維化和蛋白尿，miR-21可激活A(yù)kt信號(hào)通路導(dǎo)致腎臟肥大和纖維化。研究發(fā)現(xiàn)推動(dòng)DKD進(jìn)展的miRNA在糖尿病腎臟中表達(dá)升高，與之相反，表達(dá)

5、下降的miRNA有腎臟保護(hù)作用。
　　腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated proteinkinase，AMPK)是真核細(xì)胞中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，以異源三聚體的形式廣泛存在于真核生物體內(nèi)，是細(xì)胞的能量感受器，在能量代謝調(diào)控中起極其重要的作用。肝酶BI(liverkinase BI，LKBI)、Ca2+/CaM-依賴蛋白激酶激酶β(Ca2+/calmodulin-dependentprotein kinase

6、 kinaseβ，CaMKKβ)和AMP/ATP或ADP/ATP比值升高均可以激活A(yù)MPK，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝網(wǎng)絡(luò)，提高其應(yīng)對(duì)內(nèi)外環(huán)境變化的能力，從而維持細(xì)胞水平乃至整個(gè)機(jī)體的穩(wěn)定狀態(tài)?；罨腁MPK可以增強(qiáng)分解代謝，抑制合成代謝，上調(diào)ATP水平，參與細(xì)胞糖代謝、脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝等能量代謝過程，增加細(xì)胞能量?jī)?chǔ)備，應(yīng)對(duì)能量缺乏。同時(shí)活化的AMPK參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡、自噬等基本生物學(xué)過程。AMPK是研究糖尿病和肥胖等能量代謝

7、性疾病的核心。腎臟中的AMPK活性降低可能會(huì)引起糖尿病患者和肥胖患者中的腎臟損害。另外，AMPK的激動(dòng)劑5-氨基-4甲酰胺咪唑核糖核苷酸（5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-dribofuranoside，AICAR）可顯著改善Akita小鼠的腎臟損害和減少蛋白尿。
　　我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)miR-455能促進(jìn)棕色脂肪分化，ap2-miR-455轉(zhuǎn)基因小鼠可對(duì)抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖及糖耐量異常。mi

8、R-455可通過其靶基因HIF1AN激活A(yù)MPK信號(hào)通路。我們還發(fā)現(xiàn)miR-455在腎臟的表達(dá)僅次于脂肪。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-455在5ng/ml TGF-β處理的足細(xì)胞中降低57.2％，提示miR-455可能參與DKD的發(fā)生發(fā)展。綜上所述，我們推測(cè)，miR-455可能在糖尿病腎病的防治中具有重要價(jià)值，且目前尚未見有關(guān)miR-455與DKD之間的相關(guān)性的報(bào)道。
　　因此，本研究以體外人腎小球系膜細(xì)胞(human mesang

9、ial cells，HMCs)為模型，觀察miR-455對(duì)系膜細(xì)胞增殖水平、ECM蛋白表達(dá)和AMPK信號(hào)通路的影響，并通過調(diào)節(jié)AMPK的活性觀察其對(duì)系膜細(xì)胞以上指標(biāo)的影響，繼而探討AMPK信號(hào)通路在此過程中可能發(fā)揮的作用。
　　目的：
　　探討miR-455對(duì)高糖誘導(dǎo)下人腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響及其可能機(jī)制
　　方法：
　　細(xì)胞培養(yǎng)；
　　細(xì)胞增殖(CCK-8)檢測(cè)；
　　基因?qū)崟r(shí)熒光

10、定量PCR(qRT-PCR)。
　　結(jié)果：
　　高糖對(duì)HMCs功能及AMPK信號(hào)通路的影響
　　細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示:高糖(30 mmol/L，HG)孵育24h、48h、72h后，與低糖組（5.6 mmol/L，LG組）相比，均可明顯促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖。與低糖組相比，高糖組孵育48h可使細(xì)胞纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ，COLI)的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，可使細(xì)胞磷酸化AM

11、PK(PAMPK)、磷酸化ACC(PACC)蛋白表達(dá)明顯降低。與低糖組相比，高滲對(duì)照組（甘露醇24.4 mmoi/L+D-葡萄糖5.6 mmol/L，Man組）相關(guān)指標(biāo)無明顯變化。
　　高糖對(duì)HMCs miR-455 mRNA表達(dá)量的影響
　　qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)孵育HMCs48h后，與低糖組相比，高糖組miR-455的mRNA表達(dá)量明顯降低，高滲對(duì)照組無明顯變化。
　　miR-455模擬物、抑制物對(duì)HMCs miR

12、-455 mRNA表達(dá)量的影響
　　qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入miR-455模擬物（miR-455 mimic）組的miR-455表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，而轉(zhuǎn)入miR-455抑制物(miR-455 inhibitor)組的miR-455表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，說明轉(zhuǎn)染成功。
　　miR-455模擬物、抑制物對(duì)HMCs功能的影響
　　與HG+scramble組相比，HG+miR-455 mimic組細(xì)胞增殖水平及FN、CO

13、LI蛋白表達(dá)明顯降低。與HG+scramble組相比，HG+miR-455 inhibitor組細(xì)胞增殖水平及FN、COLI蛋白表達(dá)進(jìn)一步明顯升高。
　　miR-455模擬物、抑制物對(duì)HMCs AMPK信號(hào)通路的影響
　　與HG+scramble組相比，HG+miR-455 mimic組細(xì)胞PAMPK、PACC蛋白表達(dá)明顯升高。與HG+scramble組相比，HG+miR-455 inhibitor組細(xì)胞PAMPK、PACC

14、蛋白表達(dá)進(jìn)一步明顯下降。
　　抑制AMPK對(duì)高糖刺激下過表達(dá)miR-455的HMCs功能的影響
　　過表達(dá)miR-455及1 mmol/L AICAR預(yù)處理均可明顯抑制細(xì)胞的增殖（與HG組相比）。此外，10μmol/L compound C預(yù)處理可明顯減弱過表達(dá)miR-455的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖。過表達(dá)miR-455及1mmol/L AICAR預(yù)處理均可明顯抑制FN和COLI蛋白的表達(dá)（與HG組相比），此外，10μmol

15、/L compound C預(yù)處理可明顯減弱過表達(dá)miR-455的抑制作用，增加FN和COLI蛋白的表達(dá)。
　　抑制AMPK對(duì)高糖刺激下過表達(dá)miR-455的HMCs AMPK信號(hào)通路的影響
　　過表達(dá)miR-455及1mmol/L AICAR預(yù)處理均可明顯促進(jìn)細(xì)胞PAMPK和PACC蛋白的表達(dá)（與HG組相比）。此外，10μmol/L compound C預(yù)處理可明顯減弱過表達(dá)miR-455的促進(jìn)作用，抑制PAMPK和PACC

16、蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.體外高糖培養(yǎng)可明顯促進(jìn)HMCs增殖及FN、COLI蛋白表達(dá)，抑制AMPK和ACC磷酸化，抑制miR-455表達(dá);
　　2.過表達(dá)miR-455可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及FN、COLI蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)AMPK和ACC磷酸化。而Compound C預(yù)處理可明顯減弱過表達(dá)miR-455的作用。
　　3.抑制miR-455表達(dá)可明顯促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及FN、COLI蛋白的表達(dá)，