VEGF抗體對(duì)高糖狀態(tài)下人腎小球系膜細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和遷徒的影響.pdf

1、背景：
　　糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其特征性的病理改變?yōu)槟I小球基底膜均勻肥厚伴有腎小球系膜細(xì)胞基質(zhì)增加、腎小球囊和腎小球系膜細(xì)胞呈結(jié)節(jié)性肥厚及出現(xiàn)腎小球結(jié)節(jié)性硬化。
　　腎小球系膜細(xì)胞是腎小球毛細(xì)血管叢的主要支架，具有收縮、分泌和吞噬功能，可以根據(jù)機(jī)體需要調(diào)節(jié)收縮，從而改變腎臟濾過膜的濾過面積;對(duì)清除腎小球?yàn)V過的某些大分子物質(zhì)起著重要作用。腎小球系膜細(xì)胞的過度增生及由此引起的各種細(xì)胞因子的分泌和

2、細(xì)胞外基質(zhì)的增加在腎小球硬化的發(fā)生，發(fā)展中起著重要作用。研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)的因子，它可以促進(jìn)血管發(fā)生，血管形成，內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷徙，增強(qiáng)血管通透性，同時(shí)存在VEGF受體，通過旁分泌和內(nèi)分泌形式發(fā)揮多種病理生理作用。一定數(shù)量的VEGF對(duì)維持正常的腎小球結(jié)構(gòu)和功能是必需的，但一旦這種平衡被打破，就可能引起腎小球?yàn)V過屏障的功能變化。
　　近年來，國(guó)內(nèi)外許多研究已經(jīng)證明VEGF可能參與了糖尿病腎病

3、的發(fā)生發(fā)展，在促進(jìn)糖尿病內(nèi)皮功能紊亂以及血管病理生理過程中，VEGF可能起著重要作用。而VEGF抗體對(duì)于高糖狀態(tài)下的系膜細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖，遷徙的影響研究甚少。
　　目的：
　　本研究的目的1.以人腎小球系膜細(xì)胞為靶細(xì)胞，高糖誘導(dǎo)造成腎小球系膜細(xì)胞功能紊亂，檢測(cè)VEGF分泌量的變化;2.明確VEGF抗體在人腎小球系膜細(xì)胞糖尿病模型生長(zhǎng)、增殖和遷徙中的重要作用，為VEGF抗體應(yīng)用于糖尿病腎病的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法

4、：
　　1.建立人腎小球系膜細(xì)胞的糖尿病腎病(DN)模型:在培養(yǎng)基中添加高濃度的葡萄糖(25mol/L)，若細(xì)胞外Ⅳ型膠原、透明質(zhì)酸和纖維連結(jié)蛋白的分泌量增加，則表示建模成功。
　　2.檢測(cè)人腎小球系膜細(xì)胞DN模型自分泌的VEGF:在培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞DN模型的培養(yǎng)基中提取上清液用ELISA法檢測(cè)VEGF蛋白含量。
　　3.觀察VEGF抗體對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞DN模型生長(zhǎng)和增殖的影響:在培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞DN模型的培

5、養(yǎng)基中加入不同濃度的VEGF抗體(50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml)，24h后收獲細(xì)胞，(1)進(jìn)行AnnexinⅤ-FITC和PI雙染，通過流式細(xì)胞儀分析得到凋亡曲線(2) MTT法得到細(xì)胞增殖曲線。最后比較出不同濃度VEGF抗體對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　4.觀察VEGF抗體對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞DN模型遷徙能力的影響:將人腎小球系膜細(xì)胞DN模型加入8μm孔徑的transwell上層小室，同時(shí)加入不同濃度的VEGF

6、抗體，12h后計(jì)數(shù)進(jìn)入下層小室的細(xì)胞數(shù)量。
　　結(jié)果：
　　1.低糖培養(yǎng)條件下(5mol/L葡萄糖)，腎小球系膜細(xì)胞在顯微鏡下呈梭形或不規(guī)則形，有長(zhǎng)短不一偽足從胞質(zhì)向外伸出，高糖培養(yǎng)條件下(25mol/L葡萄糖)，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞間隙變小，細(xì)胞呈多邊形。
　　2.通過使用低糖與高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞48h后，收取上清，用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞外Ⅳ型膠原、透明質(zhì)酸和纖維連結(jié)蛋白的水平，高糖組中，Ⅳ型膠原、透明質(zhì)酸和纖維

7、連結(jié)蛋白的分泌水平均為三組中（對(duì)照組，低糖組，高糖組）最高，與其余兩組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。
　　3.ELISA方法顯示:與對(duì)照組、低糖組比較，高糖組的腎小球系膜細(xì)胞分泌VEGF量最多，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.在高糖(25mmol/L)培養(yǎng)48小時(shí)的人腎小球系膜細(xì)胞DN模型的培養(yǎng)基中加入不同濃度的VEGF抗體(50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml)，24h后收獲細(xì)胞

8、，進(jìn)行AnnexinⅤ-FITC和PI雙染，通過流式細(xì)胞儀分析得到細(xì)胞凋亡情況。隨VEGF抗體濃度升高，其細(xì)胞凋亡率并非呈線性關(guān)系，而是初始濃度升高時(shí)凋亡率升高，但到了一定濃度時(shí)(＞100 pg/ml）時(shí)出現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)期。同樣，在細(xì)胞增殖中，也與凋亡相類似，初始隨VEGF濃度升高，細(xì)胞增殖下降，但到一定濃度時(shí)(＞100 pg/ml)，細(xì)胞增殖并未出現(xiàn)繼續(xù)下降情況。
　　5.在高糖(25mmol/L)培養(yǎng)48小時(shí)的人腎小球系膜細(xì)胞DN

9、模型中提取細(xì)胞，加入8μ m孔徑的transwell上層小室，同時(shí)加入不同濃度的VEGF抗體(50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml)，12h后計(jì)數(shù)進(jìn)入下層小室的細(xì)胞數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)使用了三個(gè)濃度等級(jí)，發(fā)現(xiàn)VEGF抗體濃度一定范圍內(nèi)增高會(huì)降低系膜細(xì)胞遷徙能力。
　　結(jié)論：
　　1.高糖引起的腎小球系膜細(xì)胞VEGF表達(dá)上調(diào)，可能是糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制之一。
　　2.VEGF抗體促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞的凋亡，降低細(xì)胞增