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文檔簡介
1、目的:探討Septin2基因表達變化對大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響。
方法:培養(yǎng)原代大鼠腎小球系膜細胞,進行以下實驗:1)將綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒pEGFP-C1用電穿孔轉(zhuǎn)染的方法導入細胞,24h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。2)質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染:細胞分組:①pRK5空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,②pRK5-Septin2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,分別進行電穿孔轉(zhuǎn)染,Westernblot檢測兩組細胞Septin2蛋白質(zhì)表達水平,流式細胞儀分析S
2、eptin2對細胞周期進程的影響,Western blot檢測系膜細胞周期調(diào)節(jié)蛋白(cyclinD1、cyclinE、p21)的表達變化。3)設計合成GAPDH的siRNA,依不同濃度分為①200nmol/L,②400nmol/L,③800nmol/L組,④無關對照轉(zhuǎn)染組(siCon),電穿孔轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h,Western blot檢測GAPDH蛋白質(zhì)表達變化。4)siRNA電穿孔轉(zhuǎn)染:細胞分組:①無關對照轉(zhuǎn)染組(Sicon);②si
3、Septin2轉(zhuǎn)染組。收集細胞蛋白,Western blot檢測兩組細胞Septin2蛋白質(zhì)表達水平,流式細胞儀分析siSeptin2對細胞周期進程的影響。
結(jié)果:1)在80μg質(zhì)粒,340V電壓、550μF電容的電穿孔條件下,原代大鼠腎小球系膜細胞的電轉(zhuǎn)染效率可以達到50%以上;2)與pRK5空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,pRK5-Septin2質(zhì)??墒瓜的ぜ毎鸖eptin2的蛋白質(zhì)表達水平明顯提高(P<0.05),流式細胞儀檢測發(fā)
4、現(xiàn)pRK5-Septin2質(zhì)粒使G0/G1期細胞百分比明顯增多而S期細胞百分比顯著減少(P<0.05),同時細胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1、cyclinE表達水平下調(diào),p21的表達水平上調(diào)(P<0.05);3)siGAPDH濃度為800nmol/L時蛋白質(zhì)水平抑制效果最為顯著(P<0.05);4)與無關對照轉(zhuǎn)染組(siCon)比較,siSeptin2轉(zhuǎn)染組Septin2蛋白質(zhì)表達水平明顯降低,流式細胞儀檢測結(jié)果顯示兩組細胞G0/G1
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