鱉甲煎丸對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：系膜細(xì)胞(Mesangial cells，MCs)是腎小球中最活躍的固有細(xì)胞成分。MCs的過(guò)度增殖或凋亡減少導(dǎo)致層粘連蛋白(Laminin，LN)、Ⅳ型膠原(Collagen Ⅳ，Col-Ⅳ)和纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)等細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)成分分泌增多。MCs 過(guò)度增殖還可分泌多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，從而導(dǎo)致ECM的過(guò)量生成和多種炎癥細(xì)胞的聚積，形成腎臟纖維化。腎纖維化

2、是腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮的簡(jiǎn)稱(chēng)。研究表明，MCs能表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)及其組織抑制物(Tissue inhibitor ofmetalloproteinase，TIMPs)。MMPs/TIMPs 對(duì)腎小球基質(zhì)的降解起著重要的調(diào)控作用。MMPs 是ECM降解的關(guān)鍵酶。在MMPs 家族中MMP-9是重要成員之一，是降解Ⅳ型膠原的最主要成分。TIMP-1是MMP-9 的

3、特異性抑制因子，在ECM積聚和降解的生理平衡中起關(guān)鍵作用，其過(guò)度表達(dá)必然導(dǎo)致ECM合成過(guò)剩并大量沉積于腎小球內(nèi)導(dǎo)致腎小球硬化的發(fā)生。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming Growth Factor beta，TGF-β)在調(diào)控MCs增殖尤其是ECM的積聚中起著重要作用，其中 TGF-β<,1>是重要的致腎纖維化因子之一。因此，抑制MCs的過(guò)度增殖、減少ECM合成、糾正MMP-9/TIMP-1的失衡、抑制TGF-β<,1>的表達(dá)是延緩

4、腎纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 隨著對(duì)腎臟病發(fā)病機(jī)制的深入研究，尤其是細(xì)胞、分子學(xué)的研究，針對(duì)ECM代謝的不同環(huán)節(jié)，確立了多種對(duì)抗腎纖維化的途徑?？鼓I纖維化研究得到了很大發(fā)展，但其效果并不理想。中醫(yī)藥可以從不同環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，延緩腎纖維化的發(fā)展，具有良好的應(yīng)用前景。鱉甲煎丸為東漢末年醫(yī)圣張仲景所創(chuàng)，具有氣血同治、寒熱并用、攻補(bǔ)兼施之特點(diǎn)，是治療“瘧母”的名方。現(xiàn)在多用于治療肝炎、肝纖維化等，我們課題組將其用于治療腎纖維化，取得了一定成績(jī)。為

5、了從細(xì)胞和分子水平探討鱉甲煎丸對(duì)腎小球MCs干預(yù)的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)利用脂多糖(LPS)作為一種刺激因子，將其作用于體外培養(yǎng)的MCs中，同時(shí)以纈沙坦作對(duì)照，探討鱉甲煎丸對(duì)MCs增殖、凋亡、ECM及相關(guān)基因的干預(yù)作用。 方法 1 藥物血清制備 選年齡、體重相近的成年健康志愿者3名，其中2名分別口服鱉甲煎丸、纈沙坦，鱉甲煎丸每次4g，每日2次；纈沙坦每次80mg，每日1次，連續(xù)3d，末次用藥 1h 后無(wú)菌采靜脈血20m

6、l，分離血清，56℃30min滅活處理后用0.22um微孔濾膜過(guò)濾，-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。不服用藥物?名與前2名同時(shí)采血，分離血清備用。 2 MCs的培養(yǎng)及鑒定 MCs取自5月大的水囊引產(chǎn)胎腎，由河北醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院提供，迅速無(wú)菌取其腎臟，剝除腎包膜，將腎皮質(zhì)剪成碎屑，研磨依次通過(guò)80目、140目、220目篩網(wǎng)，收集腎小球，Ⅳ型膠原酶消化6～7min，接種于25cm<'2>培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液為含20％FCS、Hepes、青

7、霉素、鏈霉素的RPIM-1640液，并用5％NaHCO<,3>調(diào)PH值至7.2～7.4。5d左右，腎小球貼壁，周?chē)L(zhǎng)出細(xì)胞，首次換培養(yǎng)液，以后每2d換液一次。當(dāng)MCs長(zhǎng)至80％融合時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。亞培養(yǎng)的MCs生長(zhǎng)很快，36～48h 布滿(mǎn)瓶底，采用相差顯微鏡、透射電鏡及免疫組織化學(xué)方法鑒定為MCs，繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3 分組及指標(biāo)觀察 3.1 分組及培養(yǎng)測(cè)增殖以及細(xì)胞上清液中各成分含量時(shí)，將MCs以1×10<'

8、4>/孔接種于96孔板內(nèi)，24h后換成含1％胎牛血清的培養(yǎng)液孵育24h，使細(xì)胞同步于靜止期，棄上清；96孔板從左至右依次分為空白對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)“空白組”，加入5％正常人血清)、鱉甲煎組(加入5％鱉甲煎血清)、纈沙坦組(加入5％纈沙坦血清)、LPS組(加入LPS10ug/ml和5％正常人血清)、LPS鱉甲煎組(簡(jiǎn)稱(chēng)“脂甲組”，加入LPS10ug/ml和5％鱉甲煎血清)、LPS纈沙坦組(簡(jiǎn)稱(chēng)“脂坦組”，加入LPS10ug/ml和5％纈沙坦血清

9、)。共6個(gè)組，每組設(shè)有復(fù)孔(測(cè)增殖時(shí)設(shè)18個(gè)復(fù)孔；ELISA 法測(cè)LN、Col-Ⅳ、FN、MMP-9、TIMP-1時(shí)設(shè)6個(gè)復(fù)孔)。各組均加入含胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，使血清終濃度為10％，每孔培養(yǎng)液總量為200ul，37℃、5％CO<,2>培養(yǎng)箱中孵育48h，準(zhǔn)備指標(biāo)檢測(cè)。測(cè)流式及基因表達(dá)時(shí)，取第6～7代MCs以密度1×10<'6>/ml種于25em<'2>培養(yǎng)瓶中，加入1％FCS RPMI-1640 培養(yǎng)液孵育24h，使

10、之轉(zhuǎn)入G<,0>期，然后分為6組，具體分組同前。各組均加入含有胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，使血清終濃度為10％，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)、提取MCs總RNA。 3.2 MCs增殖的檢測(cè)各組培養(yǎng)24h，48h后，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)各組MCs的增殖情況。 3.3 MCs增殖、凋亡和細(xì)胞周期的檢測(cè)采用流式細(xì)胞檢測(cè)方法測(cè)定MCs增殖、凋亡和細(xì)胞周期。 3.4 細(xì)胞上清液中各成分含量的檢測(cè)

11、培養(yǎng)48小時(shí)結(jié)束后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法定量測(cè)定細(xì)胞上清夜中LN、Col-Ⅳ、FN、MMP-9、TIMP-1的含量。 3.5 FNmRNA、TGF-β<,1>mRNA的檢測(cè)采用逆轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)FNrnRNA、TGF-β<,1>mRNA的相對(duì)含量進(jìn)行檢測(cè)。 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5 for window統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±s

12、)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)利用LSP作為一種刺激因子，將其作用于體外培養(yǎng)的MCs中，用鱉甲煎丸進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)以纈沙坦作為對(duì)照進(jìn)行了研究，可以得出以下結(jié)論： 1 LPS 具有促進(jìn)MCs增殖的作用，但無(wú)明顯抑制細(xì)胞凋亡作用；鱉甲煎丸及纈沙坦藥物血清能明顯抑制正常培養(yǎng)條件及LPS 刺激條件下MCs增殖，促進(jìn)MCs凋亡。鱉甲煎丸略有優(yōu)勢(shì)。 2 LPS具有促進(jìn)ECM分泌、促進(jìn)FNmRNA表達(dá)的作用；

13、鱉甲煎及纈沙坦藥物血清能明顯抑制正常培養(yǎng)條件及LPS刺激下ECM的分泌，抑制FNmRNA表達(dá)。鱉甲煎丸優(yōu)于纈沙坦。 3 LPS具有促進(jìn) TIMP-1 表達(dá)的作用，但對(duì)MMP-9表達(dá)較弱，其結(jié)果使MMP-9/TIMP-1 比值降低；鱉甲煎丸及纈沙坦藥物血清具有抑制正常培養(yǎng)條件及LPS刺激下TMP-1 表達(dá)的作用。鱉甲煎丸及纈沙坦藥物血清促進(jìn)MCs MMP-9表達(dá)作用較弱。 4 LPS具有促進(jìn)MCs TGF-β<,1>mRN