葛根素對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響　

1、<p>　　葛根素對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響　</p><p>　　作者：解克芳　王繼峰　牛建昭</p><p>　　【摘要】 ：目的 觀察葛根素對(duì)體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞增生和凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)形成的影響。方法 用0～400 μg/mL濃度的葛根素作用于體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細(xì)胞,24～96 h后觀察不同濃度的葛根素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖活性及其功能的影響。MTT

2、法觀察成纖維細(xì)胞的生長活性,天狼猩紅染色觀察膠原生成情況。流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期時(shí)相變化。結(jié)果 80～400 μg/mL濃度作用下24～72 h范圍內(nèi),葛根素可劑量和時(shí)間依賴性地抑制人胚肺成纖維細(xì)胞的增生(P&lt;0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著濃度的增大,G0/G1期細(xì)胞百分比逐漸上升,S期細(xì)胞百分比逐漸下降,說明細(xì)胞阻滯于G0/G1期。結(jié)論 葛根素可在一定程度上抑制人胚肺成纖維細(xì)胞的增生,并誘導(dǎo)其凋亡,降低膠原的合

3、成,作用呈時(shí)間和劑量依賴性。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 葛根素　人胚肺成纖維細(xì)胞　細(xì)胞外基質(zhì)</p><p>　　Abstract：Objective To investigate the effect of puerarin on proliferation of human embro fibroblast and extracelluar matrix. Method Hu

4、man embro fibroblasts were incubated with 0～400 μg/mL puerarin for 24～96 h. The MTT method was used to assay the biological activities and extracelluar matrix formation in different time and different dose of pueratin. T

5、he cell cycle distribution was detected by flow cytometric analysis. Result Incubation cells in presence of puerarin of 40～400 μg/mL for 24～72 h c</p><p>　　Key words：puerarin；human embro fibroblast；extracell

6、uar matrix</p><p>　　肺纖維化是以成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)聚集為特征的病變。肺成纖維細(xì)胞的過度增生和分泌膠原在肺纖維化形成過程中扮演了重要的角色。因此,尋找有效藥物抑制肺成纖維細(xì)胞的過渡增生是防治肺纖維化的重要手段之一。本實(shí)驗(yàn)觀察了葛根素對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及ECM的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。</p><p><b>　　1 材料與方法</b

7、></p><p>　　1.1 主要試劑及儀器</p><p>　　人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5,中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心；MEM/NEAA培養(yǎng)液,中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；胰酶,美國Sigma公司產(chǎn)品；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(分析純,含量&gt;99%),中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清,Gibco公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)(MTT),北京科海軍舟有限公司；0.1%天狼猩紅苦味酸染

8、液,北京海德生物公司。生化培養(yǎng)箱，SANYO公司；酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀,均為美國B.D公司產(chǎn)品。</p><p>　　1.2 葛根素溶液的配制</p><p>　　以少量二甲基亞砜(DMSO)溶解后,加入MEM/NEAA配制成400 μg/mL貯存液,-20 ℃閉光保存,2周內(nèi)有效。使用時(shí)用DMEM/NEAA培養(yǎng)液稀釋至所需濃度(DMSO終濃度小于1‰,在本實(shí)驗(yàn)條件下1‰DMSO對(duì)培養(yǎng)人胚

9、肺成纖維細(xì)胞MRC-5無明顯影響)。</p><p>　　1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)</p><p>　　MRC-5細(xì)胞生長于含10%FBS、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM/NEAA培養(yǎng)液中,于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2孵育箱中培養(yǎng),24 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,96 h長滿瓶底,3～4 d更換1次培養(yǎng)液。</p><p>　　1.4

10、 葛根素對(duì)MRC-5增生的影響</p><p>　　采用MTT法檢測。取對(duì)數(shù)生長期的MRC-5細(xì)胞胰酶37 ℃消化5 min,以10%胎牛血清的MEM/NEAA培養(yǎng)液制備成1×105/mL細(xì)胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)液板中,每孔200 μL,置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),至細(xì)胞長至單層后,分別在細(xì)胞中加入不同濃度的葛根素,同時(shí)設(shè)不加藥的陰性對(duì)照和只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔

11、。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h后,每孔加入20 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清,加入200 μL DMSO,微量震蕩10 min,使MTT完全溶解,于自動(dòng)酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定各孔吸光度A值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。</p><p>　　1.5 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期時(shí)相變化</p><p>　　取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,以5×105/mL密度接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,2

12、4 h后換無血清MEM/NEAA培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,換用不同濃度的40～400 μg/mL葛根素分別作用24 h。對(duì)照組不加藥,收集貼壁細(xì)胞,4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌2次,制成單細(xì)胞懸液,70%乙醇固定,4 ℃保存過夜,-20 ℃保存,1周有效。檢測前用PBS洗去固定液,加入20 μL RnaseA,37 ℃孵育30 min后,暗處加PI染液,冰浴30 min,染色后以300目篩網(wǎng)過濾。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL,上流式

13、細(xì)胞儀檢測,作細(xì)胞周期分析。</p><p>　　1.6 膠原的檢測[1]</p><p>　　采用MTT法檢測。取對(duì)數(shù)生長期的MRC-5,用MEM/NEAA培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/mL,接種到96孔培養(yǎng)板中,每孔200 μL,37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),12 h后換用無血清培養(yǎng)液,24 h后換用含不同濃度葛根素培養(yǎng)液,另設(shè)不加藥的正常對(duì)照組,每組設(shè)4

14、個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72、 96 h后吸去培養(yǎng)液,每孔加甲醇100 μL,-20 ℃固定一夜,PBS洗1次,天狼猩紅室染1 h,0.1%醋酸洗3次,每孔加入0.1 μmol/L 20 μL,室溫震蕩1 h,于酶標(biāo)儀540 nm處檢測。</p><p>　　1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法</p><p>　　采用方差分析及t檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0處理,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果以—x&

15、#177;s表示,P&lt;0.05認(rèn)為有顯著性差異。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 葛根素對(duì)體外培養(yǎng)人胚肺MRC-5細(xì)胞增殖的影響</p><p>　　(見表1)表1 葛根素對(duì)體外培養(yǎng)人胚肺MRC-5細(xì)胞增殖的影響(略)注：與對(duì)照組比較,*P&lt;0.05,**P&l

16、t;0.01(下同)</p><p>　　MTT結(jié)果：葛根素濃度≥80 μg/mL時(shí)能顯著抑制MRC-5生長(P&lt;0.05)。40～400 μg/mL的濃度范圍,抑制強(qiáng)度隨濃度升高而加強(qiáng)(P&lt;0.05)。藥物作用時(shí)間24～96 h,抑制強(qiáng)度隨時(shí)間延長而加強(qiáng)(P&lt;0.05)。96 h時(shí)葛根素400 μg/mL對(duì)人胚肺MRC-5細(xì)胞增生抑制作用顯著(P&lt;0.01

17、)。</p><p>　　2.2 鏡下觀察葛根素處理后細(xì)胞形態(tài)的變化</p><p>　　對(duì)照組細(xì)胞：密度低時(shí),細(xì)胞長梭形或三角形,有多個(gè)細(xì)胞質(zhì)突起；細(xì)胞密度高時(shí),以長梭形為主,排列緊密,放射狀或渦旋狀,邊界不清。用藥組細(xì)胞：胞體收縮,細(xì)胞變圓,細(xì)胞間隙增寬,分布松散；胞質(zhì)內(nèi)顆粒狀物增多；高劑量時(shí)部分細(xì)胞死亡破碎浮起。</p><p>　　2.3 膠原測定結(jié)果&

18、lt;/p><p>　　隨著葛根素濃度的增加,吸光度越來越小,當(dāng)濃度≥200 μg/mL時(shí),與正常組相比較具有顯著差異。這可能說明葛根素首先抑制細(xì)胞的生長,而抑制膠原合成是繼發(fā)的現(xiàn)象。結(jié)果見表2。表2 膠原測定結(jié)果（略）</p><p>　　2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期實(shí)相的分布</p><p>　　檢測結(jié)果顯示,正常對(duì)照組細(xì)胞其G0/G1期細(xì)胞百分比76.56、

19、80 μg/mL的葛根素處理細(xì)胞其G0/G1期細(xì)胞百分比為84.72。由檢測結(jié)果可知,隨著濃度的增大,G0/G1期細(xì)胞百分比越來越大,說明細(xì)胞阻滯于G0/G1期,而進(jìn)入DNA合成期的細(xì)胞減少。</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　肺纖維化是多種原因引起的慢性肺疾病的共同結(jié)局,是多種肺疾病發(fā)展到晚期的共同病理變化。其集中表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的

20、異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積,在肺部,細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一膠原即來自于活化的成纖維細(xì)胞。由于纖維細(xì)胞的異常增殖及膠原的分泌增加在肺纖維化過程中起著重要作用[2],因此,抑制肺纖維細(xì)胞增殖是防治肺纖維化的一種有效手段。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)以人胚肺成纖維細(xì)胞為靶細(xì)胞,研究葛根素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖、形態(tài)學(xué)及膠原表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),葛根素能顯著抑制其增殖活力及DNA合成,將細(xì)胞阻止在G0/G1期,并呈劑量依

21、賴性；隨著劑量的遞增,其抑制作用也明顯增強(qiáng)。提示其可能有預(yù)防或延緩肺纖維化疾病進(jìn)程的作用。有研究表明,在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中,Ⅰ、Ⅲ型膠原合成與降解失衡起主要作用,在肺泡炎階段或肺纖維化早期主要以Ⅲ型膠原增加為主,此期病變尚可逆轉(zhuǎn),隨后病變轉(zhuǎn)為慢性,則以Ⅰ型膠原沉積為主,形成不可逆轉(zhuǎn)的改變[3-4]。天狼猩紅能與膠原緊密吸附,反應(yīng)極其穩(wěn)定,染色后不褪色,具有特異性,是目前膠原染色最好的染料。在普通光鏡下觀察,膠原纖維呈紅色。本實(shí)驗(yàn)通

22、過天狼猩紅染色發(fā)現(xiàn)葛根素組膠原表達(dá)明顯減弱。</p><p>　　綜上所述,葛根素可抑制人胚肺成纖維細(xì)胞增殖,使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期,同時(shí)能減少膠原纖維的形成。提示葛根素可能通過抑制肺成纖維細(xì)胞增殖及膠原的合成分泌而起到抗肺纖維化作用。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　　[1] Branton MH,

23、Kopp JB. TGFβ1 and fibrosis[J]. Microbes Infect, 1999,1：1349－1365.</p><p>　　[2] 趙洪文.肺成纖維細(xì)胞在肺纖維化中的作用[J].國外醫(yī)學(xué)·呼吸系統(tǒng)分冊(cè),1996,16(3)：116－117.</p><p>　　[3] 侯 杰,戴令娟.川芎嗪、丹參治療大鼠肺纖維化對(duì)Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因表達(dá)的影響[J].