光老化成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究.pdf

1、UVB是日光中的內(nèi)源成分之一，它可穿透表皮，到達(dá)主要包含纖維細(xì)胞和ECM的真皮上層。皮膚活檢提示老年人比年輕人有更多的衰老成纖維細(xì)胞。而且體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)反復(fù)的UVB輻射可導(dǎo)致HSFs發(fā)生UVB應(yīng)激誘導(dǎo)的過早衰老(stress-induced prematuresenescence SIPS)。皮膚成纖維細(xì)胞(HSFs)的一個重要的功能是維持組織中ECM的穩(wěn)態(tài)，反復(fù)UVB輻射可影響}tSFs功能，進(jìn)而改變ECM。 至今仍未見UVB

2、導(dǎo)致的：ECM改變?nèi)绾斡绊懮掀ぜ?xì)胞的生物學(xué)過程的相關(guān)研究，例如：存活、增殖、遷移、分化以及細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。目光性皮膚腫瘤的發(fā)生是從活化細(xì)胞到前腫瘤皮損，最終發(fā)展為惡性皮損。上述的生物學(xué)功能改變在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的過程中起重要作用。 現(xiàn)有的幾個研究揭示了衰老和腫瘤發(fā)生的關(guān)系，其中指出多種應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老成纖維細(xì)胞可促進(jìn)前腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖，卻不能刺激正常上皮細(xì)胞增殖。這一作用是通過分泌可溶性細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和直接

3、的細(xì)胞間相互作用。其中，ECM占到至少40％的刺激效應(yīng)。連續(xù)UVB照射誘導(dǎo)的衰老HSFs具有和其他應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老成纖維細(xì)胞相似的分泌表型，特別是某些ECM成分的增加，如：某些膠元蛋白(collagens)、纖粘蛋白(fibronectin)和骨橋素(osteonectin)等。然而，UVB-SCIP成纖維細(xì)胞分泌的ECM是否具有相似的促進(jìn)增殖的效應(yīng)仍然未有相關(guān)研究。 HaCaT細(xì)胞是人類的前腫瘤角質(zhì)細(xì)胞，其獲得了某些腫瘤易感性突

4、變，但不能在體內(nèi)形成實(shí)體腫瘤。因此是研究皮膚腫瘤形成的通用模式細(xì)胞。研究ECM對HaCaT的效應(yīng)可更好的了解其促腫瘤機(jī)制。同時，兩個已建立的模型為我們的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，其中之一是反復(fù)UVB輻射誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞(HSFs)的衰老模型；其二是HSFs生成的ECM的制備。 之前的研究提示衰老的成纖維細(xì)胞分泌的ECM可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖和加速細(xì)胞進(jìn)程。雖然導(dǎo)致這一效應(yīng)的分子基礎(chǔ)并不清楚，但現(xiàn)有研究提示在ECM和許多類型上皮

5、細(xì)胞作用中ERK1/2和P13K/AKT信號通路在其中扮演重要的存活和促增殖的角色。因此我們假設(shè)HaCaT黏附于皮膚成纖維細(xì)胞分泌的ECM可活化P13K/AKT和MAPK家族的成員如：ERK1/2，然后觀察這些信號分子的活化程度和時相性變化。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步去探詢相關(guān)的上游信號。其中，我們重點(diǎn)觀察黏著斑激酶(FAK)，它是一個125kD的酪氨酸激酶(PTK)，在胞膜內(nèi)側(cè)與整合素共定位，并在整合素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)中扮演重要的角色。在ECM

6、和整合素受體結(jié)合后被活化，進(jìn)而激活下游的P13K/AKT和RAS-RAF-ERK1/2。 在以上理論的基礎(chǔ)上，我們假設(shè)成纖維細(xì)胞分泌的ECM可通過活化ERK和P13K/AKT信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖。我們的研究提供證據(jù)證實(shí)了這一假設(shè)。靶向性干預(yù)這些信號有助于預(yù)防和治療慢性日光源性皮膚腫瘤。 方法：1)連續(xù)給予未衰老成纖維細(xì)胞亞細(xì)胞毒劑量(15mJ/cm2)UVB輻射5次，根據(jù)SA-βgal染色和DNA合成等指標(biāo)鑒定成纖維細(xì)胞

7、是否發(fā)生衰老。將衰老和未衰老的成纖維細(xì)胞接種到平皿中，然后在無血清培養(yǎng)基中育三天產(chǎn)生完整的細(xì)胞層，EDTA處理掉上層細(xì)胞，保留下層的細(xì)胞外基質(zhì)。 2)隨后將預(yù)懸浮處理的HaCaT細(xì)胞接種到預(yù)包被ECM的平皿中，細(xì)胞在EGF-free KBM培養(yǎng)基中孵育。接種后36小時收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡比率。在低密度接種HaCaT細(xì)胞96小時后，采用MTT法檢測細(xì)胞的增殖水平。 3)HaCaT細(xì)胞接種到預(yù)包被ECM的平

8、皿中，細(xì)胞在EGF-free KBM培養(yǎng)基中孵育。在接種后不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞，Westem blot法檢測FAK、ERK1/2和AKT磷酸化水平的變化。 4)在實(shí)驗(yàn)中預(yù)先采用細(xì)胞松弛素D，U0126 and wortmaninn分別處理細(xì)胞，接種后36小時收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡比率。在低密度接種HaCaT細(xì)胞96小時后，采用MTT法檢測細(xì)胞的增殖水平。在接種后不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞，Western blot法檢測FA

9、K、ERK1/2和AKT磷酸化水平的變化。 結(jié)果: 1)給予皮膚成纖維細(xì)胞連續(xù)的亞細(xì)胞毒劑量的UVB輻射，可誘導(dǎo)細(xì)胞穩(wěn)定出現(xiàn)衰老相關(guān)的標(biāo)記，如：衰老相關(guān)的半乳糖苷酶活性增高。并制備出由UVB應(yīng)激誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞和未衰老成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)包被的平皿。 2)結(jié)果顯示UVB-SIPS成纖維細(xì)胞分泌的ECM較未衰老成纖維細(xì)胞分泌的ECM和空白ECM的促增殖效果分別高13.15％and 29.27％(p<0.05)

10、。空白ECM組、未衰老ECM組和UVB-SIPS ECM組測得發(fā)生平均4.01％，5.47％和7.12％的凋亡。與空白組比較，未衰老ECM組和UVB-SIPS組細(xì)胞S期的比例分別增高23.68％和8.55％(P<0.05)。 3)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HaCaT細(xì)胞粘附于ECM(空白組、未衰老ECM組、UVB-SCIP ECM組)時，可時間依賴性的激活FAK和ERK1/2，兩者磷酸化水平在30分鐘開始升高，在120分鐘達(dá)到高峰，來源于UVB-

11、SIPS成纖維細(xì)胞的ECM可誘導(dǎo)最快而強(qiáng)烈的ERK1/2和FAK的活化； AKT無論在懸浮或貼壁的情況下均有輕度的磷酸化，而且三組中似乎未見顯著的差異。在細(xì)胞粘附中，時相性AKT僅發(fā)生輕微增加。 4)U0126預(yù)處理可完全阻斷三組細(xì)胞的ERK磷酸化，阻斷ERK信號途徑完全抑制了ECM的促進(jìn)增殖的效應(yīng)； wortmanmin預(yù)處理顯著增加三組的凋亡率，分別為15.8％、23.4％和21.8％； 2μM細(xì)胞松弛素D可抑制細(xì)胞-ECM

12、相互作用誘導(dǎo)的AKT磷酸化，并明顯減少了FAK磷酸化水平，同時細(xì)胞的凋亡率顯著增加，從而抑制ECM對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。 結(jié)論: 1)本研究顯示反復(fù)亞細(xì)胞毒劑量的UVB應(yīng)激可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞衰老，這一模型的建立為研究UVB應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老是否具有促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖以及光老化的促腫瘤機(jī)制提供了可能。 2)結(jié)果提示UVB-SCIP成纖維細(xì)胞分泌的ECM可以更強(qiáng)的促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖，此效應(yīng)更多依賴加快細(xì)胞倍增，而不是減

13、少細(xì)胞的凋亡。 3)來源于UVB-SIPS成纖維細(xì)胞的ECM可誘導(dǎo)最快而強(qiáng)烈的ERK1/2和FAK.的活化，就AKT’來看，三組中均可觀察到輕度活化，但這種差異并無顯著性。 4)ERK1/2信號途徑是通過加速細(xì)胞進(jìn)程促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而不是減少失巢和EGF-free誘導(dǎo)的凋亡；細(xì)胞粘附中，時相性AKT僅發(fā)生輕微增加，這種輕度但可檢測到的AKT活化仍然具有生物學(xué)活性，在本系統(tǒng)中P13-K/AKT是一個重要的抗凋亡信號通路，該