整合素和細(xì)胞外基質(zhì)在硬皮病與銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的比較研究.pdf

1、研究背景
　　 在過(guò)去的20年中，皮膚中整合素和ECM的表達(dá)成為了研究熱點(diǎn)。整合素家族和ECM蛋白在皮膚的不同區(qū)域和發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)變化造成了不同的粘附環(huán)境，使皮膚能夠更好地利用不同的細(xì)胞。這對(duì)于維持表皮結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定是十分有力的。硬皮病和銀屑病作為皮膚科的兩大常見(jiàn)疾病，與整合素以及ECM的關(guān)系也早有研究。然而，有研究者指出銀屑病病變發(fā)生在皮膚全層，而不是僅有表皮的異常。那么是否硬皮病的表皮也牽涉于發(fā)病機(jī)制之中呢?
　

2、　 銀屑病是以表皮過(guò)度增殖、血管內(nèi)皮異常增生和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的慢性炎癥性皮膚病。而纖維化，血管損傷甚至栓塞是硬皮病患者后期的主要病理特征。根據(jù)銀屑病和硬皮病的兩極化病理表現(xiàn)，我們大膽假設(shè)，在銀屑病和硬皮病患者的角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞中可能存在截然相反的分子改變，需要進(jìn)一步大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持這一假說(shuō)。因此，我們進(jìn)行了相關(guān)的研究。
　　 目的
　　 明確整合素α5和β4在正常人表皮，硬皮病和銀屑病皮損區(qū)角質(zhì)形成細(xì)

3、胞中的表達(dá)情況，重點(diǎn)研究不同生理、病理狀態(tài)下的角質(zhì)形成細(xì)胞中不同細(xì)胞因子對(duì)整合素α5和β4的調(diào)節(jié)作用；某些調(diào)控因素如Ca++及地塞米松對(duì)正常皮膚，硬皮病/銀屑病皮損成纖維細(xì)胞ECM蛋白，包括FN，CTGF，col-1A的表達(dá)的影響，及可能涉及的細(xì)胞通路。
　　 方法
　　 第一部分：活檢皮膚一分為二，一部分包埋制成蠟塊。另一部分分離、培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)。以免疫組化法檢測(cè)整合素α5和β4在正常皮膚，硬皮病/銀屑

4、病皮損的表達(dá)情況。以WB法檢測(cè)正常/硬皮病/銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中整合素α5和β4蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；使用外源性IL-1β，IL-13，IL-17A，TNF-α，TGF-β1，ET-1，IFN-γ，VEGF165作為刺激因子，觀察它們對(duì)不同生理、病理狀態(tài)下的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞整合素α5和β4蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)。
　　 第二部分：分離、培養(yǎng)正常真皮及硬皮病、銀屑病皮損區(qū)成纖維細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)。以WB法檢測(cè)Ca++和地塞米松對(duì)成纖維細(xì)胞E

5、CM蛋白質(zhì)(FN，CTGF，col-1A)表達(dá)的影響；以ERK/Rho/p53抑制劑阻斷相應(yīng)細(xì)胞通路，了解影響成纖維細(xì)胞ECM蛋白質(zhì)表達(dá)的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果
　　 1、整合素α5和β在正常皮膚，硬皮病/銀屑病皮損中的定位和表達(dá)
　　 1)整合素α5和β4在硬皮病中的表達(dá)：α5在正常人和硬皮病患者表皮基底層和鄰近基底層的棘細(xì)胞層表達(dá)較強(qiáng)，顆粒層和鄰近顆粒層的棘細(xì)胞層表達(dá)較少，角質(zhì)層沒(méi)有表達(dá)；而β4表達(dá)于正常人和

6、硬皮病患者表皮各層，但是在基底層表達(dá)極弱。然而β4在正常人表皮細(xì)胞的胞膜和胞漿均有表達(dá)，在硬皮病患者表皮僅在胞膜表達(dá)。α5在硬皮病患者的角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)下降，但是無(wú)顯著性差異；而β4在硬皮病患者的角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)下降，且有顯著性差異。
　　 2)整合素α5和β4在銀屑病中的表達(dá)：α5在正常人表皮除角質(zhì)層外的各層具有表達(dá)，基底層和鄰近基底層的棘細(xì)胞層表達(dá)較強(qiáng)；而在銀屑病表皮的基底層和棘細(xì)胞層均勻表達(dá)，為強(qiáng)陽(yáng)性。β4表達(dá)于正常人表皮

7、各層，但是在基底層表達(dá)極弱；然而在銀屑病患者表皮的角質(zhì)層和基底層無(wú)表達(dá)。α5和β4在正常人和銀屑病患者的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量亦有所差異：α5在銀屑病患者的角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)增加，且有顯著性差異；而β4在銀屑病患者的角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)下降，但是無(wú)顯著性差異。
　　 3)IL-17A、ET-1、TNF-α、IFN-γ對(duì)正常人和硬皮病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中整合素α5和β4的調(diào)節(jié)作用：正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-17A作用下，

8、α5蛋白質(zhì)表達(dá)略有增加；ET-1作用下，α5表達(dá)變化不明顯；而TNF-α或IFN-γ處理后，α5蛋白質(zhì)表達(dá)增加。而在硬皮病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-17A作用使α5蛋白質(zhì)表達(dá)增加；ET-1，TNF-α或IFN-γ作用后，α5蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加。正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-17A、ET-1、TNF-α或IFN-γ作用后，β4蛋白質(zhì)表達(dá)均增加。而在硬皮病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-17A、ET-1、TNF-α或IFN-γ作用后，β4蛋白質(zhì)

9、表達(dá)基本無(wú)變化。
　　 4)IL-13、IL-7A、ET-1、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、TGF-β1、VEGF165對(duì)正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中整合素α5和β4的調(diào)節(jié)作用：正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-13、ET-1、IL-17A、TNF-α或IFN-γ作用后，α5蛋白質(zhì)表達(dá)增加，TGF-β1，VEGF165對(duì)α5無(wú)影響，而IL-1β使α5表達(dá)下降。而IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α、IFN-

10、γ)、IL-1β、TGF-β1或VEGF165處理后，β4蛋白質(zhì)表達(dá)均增加，尤其是IL-13、IFN-γ、IL-β、TGF-β1和VEGF165。然而，在銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-13、ET-1、TNF-α，IFN-γ、VEGF165處理，能使α5表達(dá)減少；IL-17A能使其明顯減少；IL-1β或TGF-β1對(duì)α5無(wú)影響。IL-17A或TNF-α作用24h后，β4蛋白質(zhì)表達(dá)減少；而IL-13、ET-1、IFN-γ、IL-1β、TG

11、F-β1和VEGF165作用后，β4蛋白質(zhì)表達(dá)無(wú)影響。
　　 5)IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α，IFN-γ通過(guò)ERK通路調(diào)節(jié)正常人和銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的整合素α5和β4的表達(dá)：U0126能夠減少正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的整合素α5的蛋白表達(dá)，而對(duì)β4的表達(dá)無(wú)影響。相反地，在銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中，U0126能夠明顯減少整合素β4的蛋白表達(dá)，而對(duì)α5的表達(dá)影響不大。U0126預(yù)處理的正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL

12、-13、ET-1能夠使α5表達(dá)增加；IL-17A、TNF-α和IFN-γ能夠顯著增加α5的表達(dá)。而IL-13、IL-17A和IFN-γ會(huì)減少β4的蛋白表達(dá)；但是ET-1和TNF-α能夠增加其表達(dá)。U0126預(yù)處理的銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-13、IL-17A能夠顯著增加α5表達(dá)；而IFN-γ能夠減少其表達(dá)；ET-1和TNF-α對(duì)α5表達(dá)無(wú)影響。IL-13、IL-17A可以增加β4的蛋白表達(dá)；ET-1、TNF-α和IFN-γ對(duì)該

13、蛋白的表達(dá)無(wú)影響。
　　 2、鈣離子和地塞米松對(duì)正常皮膚及硬皮病、銀屑病皮損成纖維細(xì)胞中FN，CTGF，col-1A的調(diào)節(jié)作用
　　 1)在正常成纖維細(xì)胞中，ca++對(duì)FN和CTGF都有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，對(duì)col-1A的影響不大。而在硬皮病和銀屑病的成纖維細(xì)胞中，Ca++對(duì)FN，CTGF和col-1A均有促進(jìn)作用。
　　 2)證明ERK，Rho，p53和Smad2信號(hào)通路都與Ca++對(duì)成纖維細(xì)胞的影響相關(guān)。

14、　　 3)在dex實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，正常成纖維細(xì)胞中，dex對(duì)FN和col-1A均有抑制作用；但是對(duì)CTGF卻有促進(jìn)作用。而在硬皮病和銀屑病成纖維細(xì)胞，dex對(duì)上述三種ECM蛋白均有誘導(dǎo)產(chǎn)生的作用。
　　 4)證明ERK，Rho，p53和Smad2信號(hào)通路都與dex對(duì)成纖維細(xì)胞的影響相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 1、整合素α5在正常人和硬皮病患者表皮除角質(zhì)層外的各層具有表達(dá)，基底層和鄰近基底層的棘細(xì)胞層(暫時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞)表

15、達(dá)較強(qiáng)，而在銀屑病表皮的基底層和棘細(xì)胞層均勻表達(dá)，為強(qiáng)陽(yáng)性；
　　 2、整合素β4表達(dá)于正常人和硬皮病患者表皮各層，在基底層表達(dá)極弱。β4在正常人表皮細(xì)胞的胞膜和胞漿均有表達(dá)，在硬皮病患者表皮僅在胞膜表達(dá)。銀屑病患者表皮的角質(zhì)層和基底層不表達(dá)β4；
　　 3、體外培養(yǎng)的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞α5蛋白質(zhì)表達(dá)：和正常角質(zhì)形成細(xì)胞相比，硬皮病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞中α5表達(dá)下降，但無(wú)顯著性差異。而在銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)明顯增高，且

16、有顯著性差異；
　　 4、體外培養(yǎng)的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞β4蛋白質(zhì)表達(dá)：和正常角質(zhì)形成細(xì)胞相比，硬皮病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞β4表達(dá)明顯減少，有顯著性差異。而在銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)雖然下降，但無(wú)顯著性差異；
　　 5、接受同種細(xì)胞因子刺激后，正常皮膚和硬皮病、銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞的整合素α5和β4調(diào)節(jié)各不相同；
　　 6、鈣離子可能在硬皮病和銀屑病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用；
　　 7、地塞米松對(duì)硬皮病和銀屑病