不同分化角質(zhì)形成細(xì)胞對成纖維細(xì)胞的作用及其機(jī)理研究.pdf

1、目的分離培養(yǎng)人正常成纖維細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞，研究角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)對成纖維細(xì)胞的增殖、膠原分泌及細(xì)胞周期的影響；測定角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)，觀測角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的TGF-β1及IL-1α對成纖維細(xì)胞的增殖及Ⅲ型膠原分泌的作用；探討分化前后角質(zhì)形成細(xì)胞對成纖維細(xì)胞的增殖及膠原分泌的作用，測定其不同階段活性因子的表達(dá)差異。通過實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)，闡明在創(chuàng)傷愈合及異常瘢痕形成中角質(zhì)形成細(xì)胞的作用，從分子水平論述其

2、作用機(jī)制。 方法實(shí)驗(yàn)第一部分取小兒包皮，以消化法培養(yǎng)正常角質(zhì)形成細(xì)胞，組織塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，收集角質(zhì)形成細(xì)胞上清，配制成各種不同濃度，分別為12％，25％，50％(DMEM組為對照組)，作用于成纖維細(xì)胞，MTT法測定其增殖，羥脯胺酸比色法測定細(xì)胞外膠原分泌；50％濃度上清液及DMEM分別作用于成纖維細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定成纖維細(xì)胞周期的變化；實(shí)驗(yàn)第二部分免疫組織化學(xué)方法測定角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的IL-1α，再將實(shí)驗(yàn)分成四組，50％濃

3、度角質(zhì)形成細(xì)胞上清液(CM)為對照組，其余三組為CM+0.04mg/lIL-1α抗體，CM+0.2mg/lIL-1α抗體，CM+1mg/lIL-1α抗體，分別加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)24h，以CCK-8試劑盒測定細(xì)胞增殖，放射免疫法測定膠原分泌。實(shí)驗(yàn)第三部分與實(shí)驗(yàn)二同樣方法及分組進(jìn)行TGF-β1對成纖維細(xì)胞作用的研究，但其中TGF-β1抗體濃度分別為0.2mg/l，1mg/l，2mg/l。實(shí)驗(yàn)第四部分收集融合達(dá)90％及融合后14天角質(zhì)形成細(xì)胞

4、的上清液，分別配制成12％，25％，50％濃度，DMEM組為對照組，共七組。加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)24h，CCK-8試劑盒測定細(xì)胞增殖，放射免疫法測定膠原分泌。收集上述兩種角質(zhì)形成細(xì)胞，分別裂解后進(jìn)行WESTERN-BLOT方法檢測細(xì)胞表達(dá)TGF-β1及IL-1α的情況。其中一抗?jié)舛?，TGF-β1為1∶500，IL-1α為1∶1000，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗?jié)舛葹?∶3000。 結(jié)果在12％濃度時(shí)，角質(zhì)形成細(xì)胞的上清液即可促進(jìn)成纖維

5、細(xì)胞增殖，存在劑量效應(yīng)的關(guān)系，50％濃度的上清可明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞通過G1-S及S-G2限制點(diǎn)，在未去除成纖維細(xì)胞的增殖的影響下，角質(zhì)形成細(xì)胞上清液對成纖維細(xì)胞的膠原分泌無顯著影響。細(xì)胞爬片免疫組織化學(xué)測定可見大量胞漿被染成棕黃色的角質(zhì)形成細(xì)胞；IL-1α抗體阻斷角質(zhì)形成細(xì)胞上清后，對成纖維細(xì)胞的促增殖作用明顯減弱，而膠原分泌反而增加，在濃度為0.2mg/l時(shí)作用達(dá)高峰；TGF-β1抗體阻斷角質(zhì)形成細(xì)胞上清后，對成纖維細(xì)胞的促增殖作用及

6、膠原分泌作用均明顯減弱，在抗體濃度為1mg/l時(shí)作用達(dá)到高峰。剛?cè)诤蠒r(shí)12％、25％、50％濃度組的角質(zhì)形成細(xì)胞上清液對成纖維細(xì)胞的增殖均有促進(jìn)作用，隨濃度增高，上清液的增殖促進(jìn)作用增加，在25％時(shí)作用達(dá)到最大，融合14天后，只有50％濃度組有較弱的促進(jìn)作用。融合后12％與25％組作用的成纖維細(xì)胞中，可見大量成纖維細(xì)胞形狀變成粗短的圓形顆粒，梭形增殖的細(xì)胞明顯減少，特別是12％組增殖細(xì)胞更少，呈現(xiàn)出一種細(xì)胞抑制的狀態(tài)，50％組出現(xiàn)較多梭

7、形增殖成纖維細(xì)胞；而剛?cè)诤蠒r(shí)作用的成纖維細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞為明顯的增殖狀態(tài)。分化前上清液對成纖維細(xì)胞的膠原分泌無明顯抑制作用；分化后12％與25％組上清液對成纖維細(xì)胞的膠原分泌有明顯抑制作用；50％濃度組抑制作用不明顯。WESTERN-BLOT可見角質(zhì)形成細(xì)胞在剛?cè)诤蠒r(shí)與融合后14天相比，表達(dá)更多的IL-1α，TGF-β1。 結(jié)論在增殖期角質(zhì)形成細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞活性因子，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，對膠原分泌影響不明顯；分化后促增殖作用