成纖維細(xì)胞生長因子18對成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的作用及信號傳導(dǎo)通路的研究.pdf

1、本文研究了成纖維細(xì)胞生長因子18對成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的作用及信號傳導(dǎo)通路。具體內(nèi)容如下： 1.FGF18對成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的作用。 通過RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色的手段，分別從基因和蛋白水平證實(shí)了FGF18在永生化成牙本質(zhì)細(xì)胞系MDPC-23中表達(dá)，為進(jìn)一步研究FGF18對成牙本質(zhì)細(xì)胞的作用奠定基礎(chǔ)。再用MTT法和酶動力法檢測了不同濃度的FGF18對MDPC-23細(xì)胞增殖和ALP活性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著

2、FGF18濃度的增高和刺激時間的延長，MDPC-23細(xì)胞的增殖和ALP活性都增加。說明FGF18可以促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞的增殖和ALP活性，且呈劑量和時間依賴性。然后通過RT-PCR檢測了FGF18對MDPC-23細(xì)胞的COL1A2、基質(zhì)蛋白OC以及牙本質(zhì)特異性蛋白DSPP的表達(dá)的影響，結(jié)果顯示FGF18可促進(jìn)COL1A2、DSPP的表達(dá)，但對OC表達(dá)沒有促進(jìn)作用，說明FGF18能夠促進(jìn)前成牙本質(zhì)細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和牙本質(zhì)礦化。

3、 2.用RNAi方法研究FGF18成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的作用。 第一步：RNAi技術(shù)是最近幾年出現(xiàn)的研究基因功能的有效工具。本研究中使用的pH1/siFGF18是在pcDNA3.1+質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入H1啟動子和FGF18siRNA編碼序列構(gòu)成，首先通過瞬時轉(zhuǎn)染MDPC-23細(xì)胞發(fā)現(xiàn)FGF18的表達(dá)受到抑制，證實(shí)了pH1/siFGF18的轉(zhuǎn)染效果和siRNA的有效性。然后通過轉(zhuǎn)染MDPC-23細(xì)胞和G418篩選，建立了在mRNA

4、和蛋白水平均穩(wěn)定低表達(dá)FGF18的MDPC-23細(xì)胞模型，為探討FGF18對成牙本質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)控作用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二步：運(yùn)用穩(wěn)定低表達(dá)FGF18的MDPC-23細(xì)胞模型，研究了FGF18對成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的影響。通過細(xì)胞生長曲線、FCM檢測細(xì)胞周期等方法，發(fā)現(xiàn)FGF18基因沉默后MDPC-23細(xì)胞增殖減緩；通過對MDPC-23細(xì)胞ALP活性的檢測發(fā)現(xiàn)FGF18基因沉默后細(xì)胞ALP活性減弱；細(xì)胞外基質(zhì)蛋白COL1A2和

5、成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白DSPP的表達(dá)也隨著FGF18基因沉默而減少，從反面說明FGF18具有促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的能力。 3.MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在FGF18調(diào)控成牙本質(zhì)細(xì)胞分化中的作用。 首先檢測了FGF18刺激對MAPK通道中ERK1、P38、JNK的磷酸化狀態(tài)的影響。Western-blot結(jié)果顯示，MDPC-23細(xì)胞受到FGF18刺激后能迅速引起ERK1、P38的磷酸化，但不引起JNK的磷酸化，說明FGF1

6、8信號分子的作用主要通過激活ERK1和P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而對JNK的依賴性不大。 然后通過使用FGFR1受體抑制劑，檢測了阻斷FGF特異性受體對FGF18作用的影響以及ERK和P38的磷酸化狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用FGFR1抑制劑SU5402后，F(xiàn)GF18促進(jìn)MDPC-23細(xì)胞增殖和礦化的作用被阻斷，同時Western-blot發(fā)現(xiàn)ERK1的磷酸化被完全抑制，而P38的磷酸化不受影響。說明FGF18很可能通過FGFR1激活

7、ERK1信號傳導(dǎo)途徑，發(fā)揮促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的作用，而其它作用可能通過其它受體激活P38完成。 綜上所述，F(xiàn)GF18是一種參與調(diào)節(jié)成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的重要的信號分子，通過與特異性受體結(jié)合，激活ERK1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，還可能通過其它途徑激活P38信號傳導(dǎo)途徑來發(fā)揮作用。上述結(jié)果為今后更深入研究FGF18對成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖、礦化和損傷修復(fù)的調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為最終闡明牙齒發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了幫助。