堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：1．構(gòu)建堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因真核表達(dá)載體pEGFP-C3-bFGF；2．將pEGFP-C3-bFGF轉(zhuǎn)染至人表皮細(xì)胞，觀察基因瞬時(shí)表達(dá)情況及表皮細(xì)胞的形態(tài)和表型改變，建立bFGF基因誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?．檢測FGFR2在不同發(fā)育時(shí)期胎兒皮膚中的表達(dá)和分布，初步探索bFGF調(diào)控表皮細(xì)胞去分化的分子機(jī)制及FGFR2在皮膚發(fā)生、發(fā)育中的作用，為尋找調(diào)控表皮細(xì)胞去分化的內(nèi)在驅(qū)動(dòng)力提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為深入研究皮膚的創(chuàng)傷修復(fù)

2、與再生提供實(shí)驗(yàn)參考。 方法：1．參考分子克隆技術(shù)，采用PCR法從PBR322-bFGF質(zhì)粒中擴(kuò)增bFGF基因，同時(shí)在其兩端引入HindⅢ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，將bFGF cDNA定向插入pEGFP-C3的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C3-bFGF，并對(duì)重組子進(jìn)行DNA序列測定。2．采用脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)轉(zhuǎn)染法，將pEGFP-C3-bFGF轉(zhuǎn)染至人表皮細(xì)胞系HEKa細(xì)胞中，在

3、熒光顯微鏡下觀察基因瞬時(shí)表達(dá)情況及細(xì)胞形態(tài)。以同期培養(yǎng)的表皮細(xì)胞及pEGFP-C3轉(zhuǎn)染的表皮細(xì)胞作為陰性對(duì)照，免疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫熒光標(biāo)記法檢測實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)的改變和細(xì)胞中β1整合素、CK19、CK14及CK10表達(dá)的差異。采用RT-PCR．和Western-blot進(jìn)一步檢測pEGFP-C3─bFGF轉(zhuǎn)染后表皮細(xì)胞表型的改變，建立bFGF基因誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?．對(duì)不同發(fā)育時(shí)期胎兒皮膚取材、固定、制成石蠟切片

4、，S-P法檢測FGFR2的表達(dá)及分布。 結(jié)果：1．構(gòu)建了含有bFGF cDNA的真核表達(dá)載體pEGFP-C3-bFGF。2．熒光顯微鏡下觀察pEGFP-C3-bFGF基因轉(zhuǎn)染率為31.6％，轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞體積小，呈圓形或圓梭形，核質(zhì)比大。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CK19、CK14表達(dá)增強(qiáng)，CK10表達(dá)減弱。免疫熒光染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞主要在細(xì)胞核、胞漿和胞膜中表達(dá)CK19和CK14，在胞膜上弱表達(dá)β1整合素，而

5、CK10表達(dá)為陰性。RT-PCR結(jié)果顯示，pEGFP-C3-bFGF轉(zhuǎn)染后表皮細(xì)胞中CK19、CK14 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，而CK10的mRNA表達(dá)明顯下降。Western blot檢測結(jié)果表明，pEGFP-C3-bFGF轉(zhuǎn)染后表皮細(xì)胞中CK19、CK14的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而CK10的總體表達(dá)減少。pEGFP-C3-bFGF轉(zhuǎn)染后表皮細(xì)胞發(fā)生去分化，重新獲得干細(xì)胞的表達(dá)標(biāo)志。3．胚胎發(fā)育期FGFR2在表皮細(xì)胞表達(dá)較弱，甚至呈陰性表

6、達(dá)。表皮分層期時(shí)，表皮層開始增厚，并可見毛囊的初級(jí)原基；FGFR2在表皮層和毛囊初級(jí)原基內(nèi)呈弱陽性表達(dá)。毛囊形成期時(shí)，毛囊的結(jié)構(gòu)初步形成，體積細(xì)小，形態(tài)幼稚;FGFR2主要在毛母質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且隨著胎齡增加，表達(dá)范圍逐漸擴(kuò)大，表達(dá)量逐漸增多。毛囊發(fā)育成熟期后，毛囊的結(jié)構(gòu)發(fā)育相對(duì)成熟,FGFR2則在表皮層、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及皮脂腺的導(dǎo)管部均有表達(dá)，尤其在毛母質(zhì)細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)。 結(jié)論：1.將bF-GF基因插人pEGFP-C3的C

7、末端，可以提高bFGF在真核細(xì)胞中的表達(dá)，而且不影響其目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。2. pEGFP - C3 - bFGF能夠轉(zhuǎn)染至人表皮細(xì)胞并表達(dá)，在pEG-FP-C3-bFGF轉(zhuǎn)染作用后，表皮細(xì)胞重新程序化，并獲得其前體干細(xì)胞的某些潛在能力，表達(dá)表皮干細(xì)胞的一些未分化蛋白，成功建立bFGF基因誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，為進(jìn)一步闡述bFGF調(diào)控表皮細(xì)胞去分化的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為尋找調(diào)控表皮細(xì)胞去分化的內(nèi)在驅(qū)動(dòng)力提供實(shí)驗(yàn)參考。3