β-硫基乙醇和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化神經(jīng)元細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：⑴大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)特性，探討MSCs的體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增的規(guī)律和特點(diǎn)。建立SD大鼠骨髓間充質(zhì)于細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。⑵采用β-硫基乙醇（β-ME）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）作為誘導(dǎo)劑，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）進(jìn)行體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。探討β-ME和bFGF體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化神經(jīng)元細(xì)胞的機(jī)制，為脊髓損傷的細(xì)胞移植治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：①取一月齡SD大鼠股骨和脛骨，采用全骨髓培養(yǎng)法，以L-DMEM

2、完全培養(yǎng)基沖出骨髓過(guò)濾后直接接種于培養(yǎng)瓶中，3天后首次換液，以后每3天換液一次。至細(xì)胞融合達(dá)80％以上時(shí)，進(jìn)行傳代。②取第1、4、7、10、13代細(xì)胞，觀察其細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及貼壁率。③取第4代細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。④取P4代的rBMSC，以2×104/ml濃度接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞達(dá)到70％～80％融合時(shí)，分別加入β-硫基乙醇（β-ME）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)變化。⑤采用細(xì)胞免疫熒光方

3、法，對(duì)以上兩組細(xì)胞誘導(dǎo)后5h后檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)志物TuJ1和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)情況，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。⑥熒光顯微鏡下在各組細(xì)胞隨機(jī)取300個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)TuJ1反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，檢驗(yàn)各組不同時(shí)間點(diǎn)的差異，以及每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組間的差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)均以x±s表示，并用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。⑦免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)分化細(xì)胞的特異性標(biāo)志物分別取誘導(dǎo)分化后0h，1h，5h后的細(xì)胞，

4、使用2X SDS sample buffer裂解細(xì)胞，進(jìn)行神經(jīng)元特異性蛋白TuJ-1和星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白GFAP的定量分析。 結(jié)果：⑴貼壁篩選法，通過(guò)多次換液可以分離、純化BMSC，該法簡(jiǎn)單、方便、效果好。⑵BMSC在體外培養(yǎng)中有很強(qiáng)的增殖能力，10代以前的細(xì)胞形態(tài)較一致，增殖能力強(qiáng)，隨傳代次數(shù)的增加，增殖能力減弱，形態(tài)發(fā)生不規(guī)則變化。細(xì)胞生長(zhǎng)的第1、4、7、10、13代的貼壁率變化規(guī)律基本相同，無(wú)顯著區(qū)別。傳代后細(xì)胞貼壁率

5、隨時(shí)間延長(zhǎng)而增高。⑶rBMSC的表面標(biāo)志抗原呈現(xiàn)多樣性的特征，rBMSC不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原CD34、CD45，說(shuō)明rBMSC非造血類細(xì)胞；而其表達(dá)CD90、CD44，說(shuō)明rBMSC的表面標(biāo)志具有非單一性的特性。它表達(dá)了間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志。⑷第4代rBMSC加入誘導(dǎo)劑后可分化為神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。可見(jiàn)光下觀察：前者細(xì)胞體積較小數(shù)量較少，常有數(shù)個(gè)短小突起和一個(gè)較長(zhǎng)的突起，呈典型的雙極、多極或錐形，具有較強(qiáng)的折光

6、性；后者細(xì)胞體積較大，細(xì)胞突起較多且粗，有些形態(tài)呈星狀，有許多突起呈放射狀伸出，平鋪在培養(yǎng)皿上。⑸細(xì)胞免疫熒光結(jié)果示細(xì)胞誘導(dǎo)后5h，部分細(xì)胞TuJ1反應(yīng)陽(yáng)性，為神經(jīng)元細(xì)胞；部分細(xì)胞GFAP反應(yīng)陽(yáng)性，為星形膠質(zhì)細(xì)胞。⑹rBMSC誘導(dǎo)為神經(jīng)元細(xì)胞陽(yáng)性率比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，誘導(dǎo)后β-ME組1h，5h分化率最高，24h bFGF組分化率最高，與其它組有顯著差異（P<0.01）；β-ME組在誘導(dǎo)24h后多數(shù)細(xì)胞已死亡，無(wú)法統(tǒng)計(jì)。β-ME組1h與5

7、h的分化率有顯著差異（P<0.01）；bFGF組5h和24h的分化率與1h的分化率有顯著差異（P<0.01），但5h和24 h的分化率無(wú)顯著差異（P>0.05）。⑺Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，在上樣20ug總蛋白，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，rBMSC誘導(dǎo)分化后，表達(dá)TUJ-1和GFAP的量明顯增加。并且，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增多。 結(jié)論：①本實(shí)驗(yàn)采用骨髓直接培養(yǎng)法來(lái)分離培養(yǎng)BMSC