重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-8a的純化研究.pdf

1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-8a(fibroblast growth factor-8a, FGF8a)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(fibroblast growth factor family, FGFs家族)的第8個(gè)成員FGF8的a亞型,不僅是胚胎發(fā)育階段必需的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子,更有多種生物學(xué)功能,能夠高效安全地促進(jìn)組織損傷的修復(fù),還在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中起重要的營(yíng)養(yǎng)和誘導(dǎo)作用,因此具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。重組人FGF8a(recombinant

2、 human fibroblast growth factor-8a,rhFGF8a)是將人FGF8a基因經(jīng)過體外改造克隆后以生物工程菌表達(dá)得到的多肽,具有與天然FGF8a相同的活性。同時(shí),與從天然動(dòng)物組織中提取的FGF8a相比,更具有產(chǎn)量高、成本低,資源豐富等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用前期已經(jīng)構(gòu)建成功的FGF8a-pET28a-Rosetta作為表達(dá)菌株,經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside

3、,IPTG)誘導(dǎo)、菌體破碎后發(fā)現(xiàn),在可溶和不可溶的胞質(zhì)組分當(dāng)中,均有rhFGF8a的存在。但通過嘗試多種純化方式發(fā)現(xiàn),以可溶形式表達(dá)的目的蛋白難以純化,而以包涵體形式表達(dá)的rhFGF8a只需經(jīng)過一次鎳柱親和層析便可以獲得純度高達(dá)95%以上的目的蛋白。本文還通過平行對(duì)比實(shí)驗(yàn),對(duì)rhFGF8a的復(fù)性條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,FGF8a稀釋到50μg/ml,在pH值為8.0,添加了氧化/還原型谷胱苷肽的復(fù)性緩沖液里的復(fù)性效果最好。將純化后的

4、蛋白用MTT法進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè),結(jié)果顯示,FGF8a對(duì)成纖維細(xì)胞具有一定的促增長(zhǎng)作用。ED50約為50ng/ml。rhFGF8a的等電點(diǎn)為10.5,是一種強(qiáng)堿性蛋白,不利于純化。按一般經(jīng)驗(yàn),蛋白質(zhì)在帶負(fù)電荷時(shí)復(fù)性效果較好,但對(duì)于等電點(diǎn)高達(dá)10.5的rhFGF8a而言,這是不可行的。本研究通過對(duì)各種條件的摸索,在蛋白帶正電荷的情況下,成功地獲得了純度達(dá)95%以上并具有一定生物活性的rhFGF8a蛋白。這對(duì)其它強(qiáng)堿性蛋白的純化起到了一定的參