重組人成纖維細胞生長因子家族N末端聚乙二醇化學修飾.pdf

1、人成纖維細胞生長因子-10(Human fibroblast growth factor-10；KGF-2；又稱為角化細胞生長因子-2(Keratinocyte Growth Factor-2))系成纖維細胞生長因子家族的重要成員,它是來源于胚胎上皮細胞的一種堿性蛋白,由208個氨基酸殘基組成,主要在間充質細胞合成,通過與上皮細胞細胞膜上的受體作用,特異性促進上皮細胞的增殖、分化和遷移。KGF-2在新生或成年間質成纖維細胞系、成年人的腎

2、、胃腸道臟器等均有表達。KGF-2的作用主要表現(xiàn)為抗肝肺組織纖維化、促進創(chuàng)傷性組織損傷、慢性組織損傷(糖尿病患者的持續(xù)性損傷)以及靜脈潰瘍(包括腸胃的慢性潰瘍)的修復和愈合等,具有廣泛的應用前景,但是,長期的研究及臨床實踐表明KGF-2與其它蛋白質藥物一樣,也存在體內穩(wěn)定性差、生物半衰期短、易發(fā)生免疫應答反應等缺陷,從而也大大限制了臨床應用。
　　 為了提高KGF-2的穩(wěn)定性、延長半衰期,本文使用目前應用較多的專門針對N末端氨基

3、修飾的PEG-20KD丁醛修飾制劑,采用正交實驗考察了不同溫度、反應時間、緩沖溶液(PBS)pH值及修飾制劑和蛋白質物質量之比四個因素對修飾結果的影響。并對修飾產(chǎn)物的分離制備、活性、穩(wěn)定性、免疫反應性和免疫原性、藥動學特點作了較為系統(tǒng)的研究,結果如下:
　　 1)以PEG20kd與rhKGF-2在摩爾比為9:1,溫度為25℃,pH為6.0,時間為15h反應條件下修飾率最高,將反應產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳,經(jīng)凝膠掃描和HPLC

4、分析,修飾率最高達到31.63％:
　　 2)將反應物采用肝素親和層析,采用梯度洗脫來進行分離純化,SDS-PAGE電泳結果顯示,0.6mol/L NaCl+20mmol/LPBS的洗脫峰即為PEG-rhKGF-2,采用反相高效液相色譜(C18柱)分析純化得到的PEG-rhKGF-2的,其純度超過99％:
　　 3)用細胞增殖實驗檢測修飾產(chǎn)物的活性,結果表明PEG-rhKGF-2有更著的促NRK52E細胞增殖作用,并且在

5、一定的濃度范圍內促進作用與劑量成正相關；
　　 4)穩(wěn)定性結果檢測表明,修飾產(chǎn)物在大鼠血清中熱穩(wěn)定性明顯高于修飾前的rhKGF-2,同時PEG-rhKGF-2比rhKGF-2抗胰蛋白酶水解能力明顯增加；
　　 5)修飾產(chǎn)物的體內藥代動力學研究表明,rhKGF-2經(jīng)PEG化學修飾后,體內半衰期(t1/2)提高了將近6倍,由2.6 min提高到15.5 min；
　　 6)修飾產(chǎn)物的體內免疫原性檢測表明,rhKGF-