草魚成纖維細胞生長因子-8（FGF8）的cDNA克隆與序列分析.pdf

1、成纖維細胞生長因子8(Fibroblast．growth factor 8，F(xiàn)GF8)是最初從一種小鼠雄激素依賴性乳腺癌細胞系SC-3的培養(yǎng)液中分離出來的成纖維細胞生長因子家族的成員，與FGF18和FGF17屬于同一個亞家族。研究證實FGF8是一種組織發(fā)育過程中的重要分泌性信號分子，參與多種組織的發(fā)育，尤其在腦等外胚層器官的發(fā)育過程中起了重要作用。此外，F(xiàn)GF8能有效促進組織損傷的修復，在神經(jīng)干細胞培養(yǎng)過程也起重要的誘導作用。

2、本研究以草魚為實驗對象，運用了逆轉錄PCR結合RACE方法克隆草魚FGF8 cDNA序列，并運用生物信息學手段對其進行分析，旨在揭示魚類疾病的病理機制、了解草魚胚胎發(fā)育過程中的細胞生長、組織形成的生理調控機理。經(jīng)：PCR條件的優(yōu)化，最終克隆出了草魚成纖維細胞生長因子-8(FGF8)的cDNA序列，并對其進行深入的分析。 1．從草魚腦中提取總RNA。以總RNA為模板，利用AMV反轉錄酶和試劑盒自帶的oligodT-3 sites

3、Adaptor primer為引物，合成第一鏈cDNA。接下來的PCR反應中，以第一鏈cDNA為模板，人工合成的寡聚核苷酸引物為引物，用Taq DNA聚合酶進行擴增反應。反應條件為94℃變性60 see，48℃退火60 see，72℃延伸90 see，反應40循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物轉化進大腸桿菌(DH5a)中，用于測序。結果顯示，草魚成纖維細胞生長因子-8 cDNA序列長度為887 bp，包括一個長度為100個核苷酸的5’非編碼區(qū)序列(．

4、5'UTR)，起始密碼子(ATG)、編碼210個氨基酸的開放閱讀框(ORF)、終止密碼子(TGA)和一個包括加尾信號(AATAAA)、poly(A)信號的3'非編碼區(qū)序列(3'UTR)，3'非編碼區(qū)長度為97個核苷酸。編碼區(qū)核苷酸長度為687 bp。經(jīng)同源性比較分析，可以確定實驗結果為FGF8 cDNA序列。 2．草魚FGF8編碼的氨基酸多肽鏈全長210個氨基酸，包含40個堿性氨基酸、16個酸性氨基酸。草魚FGF8蛋白質的N端區(qū)

5、域包含一個氨基酸序列為MRLIPSRLSYLFLFAFCYYA的信號肽，切割位點在Ala22和Gln23之間。蛋白質N-末端的信號肽被認為是分泌蛋白的明顯特征，提示草魚FGF8蛋白是分泌蛋白。氨基酸的一級結構中在Asn37和Asn136氨基酸位點出現(xiàn)N-糖基化結構，分別為Asn-Phe-Thr和Asn-Tyr-Thr。草魚FGF8推導蛋白的分子量Mw=24.68 kDa，等電點pI=10.93。其二級結構包含a-螺旋、β-轉角、β-折疊

6、、隨機卷曲等結構形式。從分析圖中可以看出，β-折疊的比例比較高，其次是α-螺旋，β-轉角、隨機卷曲含量最少。 3．系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析顯示，鯉科魚類的FGF8蛋白很相似，斑馬魚、墨西哥脂鯉兩種鯉科魚類的FGF8蛋白均含有210個氨基酸，同源性97.1％。本實驗克隆的草魚FGF8蛋白也具有210個氨基酸，與上述兩個鯉科魚類的FGF8氨基酸序列同源性達到97％以上。此外，草魚FGF8蛋白與其他物種也有很高的同源性，如與雞、斑點火蜥蜴、