成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)對骨形成的直接調(diào)控作用.pdf

1、成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)屬于受體酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)家族。目前已發(fā)現(xiàn)4種FGFRs，即FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4。它們之間在氨基酸水平有55％～72％的一致性。
　　 既往研究表明，F(xiàn)GF/FGFRs信號通路與骨骼發(fā)育、再生和骨骼疾病有密切聯(lián)系。
　　 FGFR1

2、、2、3 功能增強或喪失突變可導(dǎo)致包括顱縫早閉(craniosynostosis, CS)、軟骨發(fā)育不全(achondroplasia, ACH)和CATSHL (camptodactyly, tall stature, scoliosis, andhearing loss)綜合征在內(nèi)的多種人類骨骼系統(tǒng)遺傳性疾病。
　　 骨骼的發(fā)育是通過軟骨內(nèi)成骨(endochondrAlossification)和膜內(nèi)成骨(intramemb

3、ranousossification)兩種方式來完成的。軟骨內(nèi)成骨又經(jīng)過軟骨形成(chondrogenesis)和骨形成(osteogensis)兩個密切相關(guān)的過程。而膜內(nèi)成骨則是一個單獨的骨形成的過程，即間充質(zhì)密集后直接分化為成骨細胞并成骨。
　　 不同的FGFRs在軟骨形成和骨形成過程中的作用不一致。總的講，目前認為FGFR1、2 主要調(diào)節(jié)膜內(nèi)成骨過程，而FGFR3 則主要參與調(diào)控軟骨內(nèi)成骨。已發(fā)現(xiàn)人類FGFR1(P252R

4、)功能增強點突變和多種FGFR2 功能增強點突變可影響顱縫膜內(nèi)成骨過程，導(dǎo)致顱縫提前閉合，引起囟門早閉綜合征；而FGFR3 功能增強點突變通過抑制生長板軟骨發(fā)育，導(dǎo)致軟骨發(fā)育不全等軟骨發(fā)育障礙性疾病。
　　 FGFR3和FGFR1、2 高度同源，也受可調(diào)節(jié)骨形成的內(nèi)源性配體FGF2、18等激活，提示FGFR3 可能參與調(diào)控骨形成過程。而人類FGFR3 A391E 功能增強型點突變可引起Crouzon等囟門早閉征，則是FGFR3

5、影響骨形成的直接證據(jù)。模擬人ACH的FGFR3 突變小鼠出生后15天長骨骨小梁處成骨細胞分化標志基因Cbfa1等表達水平增高，成年期骨量減少；FGFR3 敲除小鼠骨量減少，骨小梁礦化障礙。這些結(jié)果均提示FGFR3 可影響成骨細胞功能和骨形成過程。
　　 目前已有多名學(xué)者報道利用條件性基因敲除小鼠研究FGFR1、2對成骨細胞的直接調(diào)控作用，但關(guān)于FGFR3對成骨細胞及骨形成的直接調(diào)控作用及機制還不完全清楚。
　　 骨損傷后

6、的再生修復(fù)是局部骨骼的再發(fā)育過程。一些參與調(diào)控骨骼發(fā)育的分子如IHH/PTHrP、BMPs、Wnt等在骨再生過程中也起著重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR3參與調(diào)節(jié)骨損傷后的再生過程，且在一定程度上，F(xiàn)GFR3對骨再生和骨生長發(fā)育中的軟骨內(nèi)成骨過程可能發(fā)揮相似的負性調(diào)控作用。而Rundle等發(fā)現(xiàn)FGFR3表達于骨折部位成骨細胞和骨膜下間充質(zhì)細胞，提示FGFR3 直接參與調(diào)控骨再生過程中的成骨細胞骨形成過程。那么FGFR3在骨再生過程中對成

7、骨細胞骨形成的影響是否與FGFR3在成年期骨重建中的作用類似呢？
　　 據(jù)此，本課題用成骨細胞特異性表達FGFR3 功能增強點突變(FGFR3K644E,Oc-cre)小鼠和模擬人軟骨發(fā)育不全的FGFR3 功能增強點突變(FGFR3G369C/+)小鼠兩種基因敲入小鼠模型為研究對象，探討生理和病理(骨損傷)情況下，F(xiàn)GFR3對成骨細胞及骨形成的直接調(diào)控作用。
　　 主要研究內(nèi)容：
　　 第一部分:成骨細胞特異性表

8、達含功能增強點突變FGFR3對成年期小鼠骨形成的影響1.對成骨細胞特異性表達FGFR3 功能增強點突變(FGFR3K644E,Oc-cre)小鼠身長，尾長，體重等形態(tài)學(xué)指標進行大體觀察。
　　 2.利用藏紅固綠染色觀察新生小鼠脛骨生長板軟骨發(fā)育情況。
　　 3.利用X 線攝片和Micro-CT 觀察成年小鼠股骨骨密度及骨組織結(jié)構(gòu)的變化。
　　 4.通過H&E 染色、鈣綠素雙標實驗觀察小鼠脛骨骨小梁的結(jié)構(gòu)及礦化情況

9、；測定血清鈣磷含量，了解體內(nèi)鈣磷水平是否受骨骼代謝異常影響；定量PCR 檢測成骨細胞分化標志基因Cbfa1、OC、OP、Col1a1等的表達變化。
　　 5.小鼠顱骨成骨細胞分離培養(yǎng)，測定生長曲線并進行成骨誘導(dǎo)。通過堿性磷酸酶染色、茜素紅染色觀察，結(jié)合檢測成骨相關(guān)基因Cbfa1、OC、OP、Col1a1以及FGFR1、FGFR2和BMPRIA的表達，觀察成骨細胞分化和礦化情況。
　　 6.通過TRAP 染色觀察脛骨破骨細

10、胞形成及活性。
　　 第二部分：FGFR3 功能增強對小鼠脛骨骨皮質(zhì)損傷修復(fù)過程的影響1. 建立FGFR3 功能增強小鼠(FGFR3G369C/+)脛骨皮質(zhì)缺損模型。
　　 2.利用H&E 染色和Micro-CT 重建分析觀察骨再生情況。
　　 3.定量PCR 檢測新生骨組織中成骨細胞分化相關(guān)基因Cbfa1、OC、OP、Col1a1等mRNA水平表達變化。
　　 主要實驗結(jié)果：
　　 一. FGF

11、R3K644E,Oc-cre小鼠骨形成增加，體型變小1. 成年期(2月齡)FGFR3K644E,Oc-cre小鼠體型變小，體重減輕；新生小鼠長骨生長板軟骨發(fā)育無異常。
　　 2.成年期FGFR3K644E,Oc-cre小鼠骨量增多，骨形成增加X 線攝片顯示FGFR3K644E,Oc-cre小鼠股骨放射密度增高；Micro-CT 掃描顯示FGFR3K644E,Oc-cre小鼠BV/TV，骨小梁數(shù)量（Tb.N)及骨小梁厚度（Tb.T

12、h)均顯著升高；H&E 染色FGFR3K644E,Oc-cre小鼠干骺端和骨骺部位骨小梁較野生小鼠明顯增多、增長、增粗。提示成年期FGFR3K644E,Oc-cre 骨量增多，骨形成增加。
　　 3.FGFR3K644E,Oc-cre小鼠成骨細胞分化增強，礦化障礙1) 2月齡FGFR3K644E,Oc-cre小鼠脛骨骨組織中成骨細胞分化標志基因Cbfa1、OP和Col1a1表達上調(diào)，表明成骨細胞分化增強；鈣綠素雙標實驗提示FGF

13、R3K644E,Oc-cre小鼠礦化能力減弱；體內(nèi)血清鈣磷含量正常，提示骨骼礦化障礙沒有影響全身鈣磷水平。
　　 2) FGFR3K644E,Oc-cre小鼠顱骨成骨細胞增殖減慢；經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后堿性磷酸酶表達增加，鈣結(jié)節(jié)形成減少；成骨細胞分化標志基因Cbfa1、OP、OC、Col1a1表達均顯著上調(diào)，表明成骨細胞分化增強，礦化降低。
　　 3) FGFR3K644E,Oc-cre小鼠成骨相關(guān)基因FGFR1、FGFR2及

14、BMPRIA表達下調(diào)。
　　 4.FGFR3K644E,Oc-cre小鼠破骨細胞骨吸收作用沒有改變TRAP 染色后計數(shù)結(jié)果顯示FGFR3K644E,Oc-cre小鼠脛骨單位骨小梁面積上的破骨細胞數(shù)量與野生小鼠無明顯差別，提示FGFR3K644E,Oc-cre小鼠破骨細胞數(shù)量及功能無明顯改變。
　　 二. FGFR3G369C/+小鼠脛骨骨皮質(zhì)損傷愈合延遲1. FGFR3G369C/+小鼠骨皮質(zhì)損傷后局部新生骨組織增多Mi

15、cro-CT 掃描重建分析及H&E 染色顯示FGFR3G369C/+小鼠損傷局部新生骨組織數(shù)量和體積較野生小鼠增加；新生骨組織成骨細胞分化標記基因Cbfa1、OP等表達顯著上調(diào)，提示成骨細胞分化增強。
　　 2.FGFR3G369C/+小鼠皮質(zhì)骨愈合延遲MicroCT 掃描重建分析及H&E 染色顯示在損傷后第21天，野生型小鼠和FGFR3G369C/+小鼠在皮質(zhì)缺損處都出現(xiàn)了新生板層骨，但FGFR3G369C/+小鼠的新生骨皮質(zhì)

16、厚度要小于野生小鼠。
　　 主要結(jié)論：
　　 1.成骨細胞特異性表達FGFR3 功能增強點突變小鼠體型變小，但生長板軟骨未見明顯異常，提示成骨異常在ACH 侏儒體型發(fā)生中有一定作用。
　　 2.成骨細胞特異性表達FGFR3 功能增強點突變小鼠成年期骨形成增加，導(dǎo)致骨量增多。
　　 3.FGFR3 功能增強促進成骨細胞分化，抑制其礦化。
　　 4.FGFR3 功能增強對成骨細胞的影響可能部分是通過F