成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)激活在小鼠腦出血模型中的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：FGFR激活對(duì)小鼠腦出血后損傷保護(hù)作用
　　目的：研究FGFR激動(dòng)劑對(duì)小鼠腦出血后腦組織FGFR的激活及對(duì)小鼠腦出血后損傷的保護(hù)作用。
　　方法：雄性CD-1小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、PBS對(duì)照組及FGFR激動(dòng)劑治療組。
　　第一節(jié)，建立膠原酶誘導(dǎo)小鼠右基底節(jié)腦出血模型，使用 FGF2100ng或PBS在小鼠腦出血后30分鐘行左側(cè)腦室微量注射治療，于腦出血后24小時(shí)及72小時(shí)檢測(cè)小鼠神經(jīng)行為功能評(píng)分并處死后檢測(cè)腦

2、水腫腦水腫。
　　第二節(jié)，應(yīng)用膠原酶誘導(dǎo)小鼠右基底節(jié)腦出血模型，使用 FGF230ng、FGF1100ng或PBS在小鼠腦出血后30分鐘行左側(cè)腦室微量注射治療，于腦出血后72小時(shí)檢測(cè)小鼠神經(jīng)行為功能評(píng)分并處死后檢測(cè)腦水腫。
　　第三節(jié)，應(yīng)用膠原酶誘導(dǎo)小鼠右基底節(jié)腦出血模型，使用 FGF2100ng或PBS在小鼠腦出血后30分鐘行左側(cè)腦室微量注射治療，于腦出血后72小時(shí)檢測(cè)小鼠腦出血量。
　　第四節(jié)，應(yīng)用自體注血小鼠基底

3、節(jié)腦出血模型，使用FGF2100ng或PBS在小鼠腦出血后30分鐘行左側(cè)腦室微量注射治療，于腦出血后72小時(shí)檢測(cè)小鼠神經(jīng)行為功能評(píng)分并處死后檢測(cè)腦水腫。
　　第五節(jié)，應(yīng)用膠原酶誘導(dǎo)小鼠右基底節(jié)腦出血模型，使用 FGF2100ng或PBS在小鼠腦出血后30分鐘行左側(cè)腦室微量注射治療，于腦出血后72小時(shí)通過(guò)檢測(cè)Evans Blue在小鼠腦出血后血腦屏障的透過(guò)性評(píng)價(jià)小鼠血腦屏障通透性。
　　第六節(jié)，應(yīng)用膠原酶誘導(dǎo)小鼠右基底節(jié)腦出血

4、模型，使用 FGF2100ng或PBS在小鼠腦出血后30分鐘行左側(cè)腦室微量注射治療，于腦出血后72小時(shí)通過(guò)western-blot方法檢測(cè)FGFR磷酸化水平即FGFR激活水平。
　　結(jié)果：第一節(jié)，膠原酶誘導(dǎo)小鼠右基底節(jié)腦出血模型腦出血后24及72小時(shí)，與假手術(shù)組比較小鼠病側(cè)基底節(jié)區(qū)腦水腫顯著升高（P＜0.05）。FGF2100ng治療組與對(duì)照組比較腦出血后72小時(shí)小鼠病側(cè)基底節(jié)區(qū)腦水腫顯著降低（P＜0.05），神經(jīng)功能評(píng)分顯著改善

5、（P＜0.05）。FGF2100ng治療組與對(duì)照組比較腦出血后24小時(shí)病側(cè)基底節(jié)區(qū)腦水腫呈降低趨勢(shì)，神經(jīng)功能評(píng)分呈改善趨勢(shì)，但未達(dá)到顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)（P＞0.05）。
　　第二節(jié)，F(xiàn)GF230ng治療組與對(duì)照組比較腦出血后72小時(shí)小鼠病側(cè)基底節(jié)區(qū)腦水腫及神經(jīng)功能評(píng)分均有顯著性改善（P＜0.05），但改善水平較FGF2100ng治療組低（P＜0.05）。FGF1100ng治療組與對(duì)照組比較腦出血后72小時(shí)小鼠病側(cè)基底節(jié)區(qū)腦水腫明顯降低

6、（P＜0.05），神經(jīng)功能評(píng)分顯著改善（P＜0.05)。
　　第三節(jié)，腦出血后72小時(shí)，F(xiàn)GF2100ng治療組與PBS對(duì)照組小鼠腦出血量無(wú)顯著性差異（p=0.747）。
　　第四節(jié)，自體注血小鼠右基底節(jié)腦出血模型中腦出血后72小時(shí)，與假手術(shù)組比較小鼠病側(cè)基底節(jié)區(qū)腦水腫顯著升高（P＜0.05），神經(jīng)行為功能損害明顯（P＜0.05）。FGF2100ng治療組與對(duì)照組比較腦出血后72小時(shí)小鼠病側(cè)基底節(jié)區(qū)腦水腫顯著降低（P＜0.0

7、5），神經(jīng)功能評(píng)分顯著改善（P＜0.05）。
　　第五節(jié)，膠原酶誘導(dǎo)小鼠右基底節(jié)腦出血模型腦出血后72小時(shí)，與假手術(shù)組比較小鼠病側(cè)大腦Evans Blue透過(guò)率顯著升高（P＜0.05）。FGF2100ng治療組與對(duì)照組比較小鼠病側(cè)大腦Evans Blue透過(guò)率顯著降低（P＜0.05）。
　　第六節(jié)，膠原酶誘導(dǎo)小鼠右基底節(jié)腦出血模型腦出血后72小時(shí)，與假手術(shù)組比較小鼠病側(cè)大腦磷酸化FGFR水平無(wú)顯著改變（P＞0.05）。FGF

8、2100ng治療組與對(duì)照組比較小鼠病側(cè)大腦磷酸化FGFR水平顯著升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：在膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型和自體注血腦出血模型中，小鼠腦出血后神經(jīng)行為功能受損，血腦屏障通透性增加，腦水腫升高。FGFR激動(dòng)劑FGF1和FGF2激活FGFR，降低小鼠血腦屏障通透性，減輕腦水腫，改善神經(jīng)行為功能評(píng)分，其保護(hù)性作用具有劑量正效應(yīng)。FGF2治療不影響膠原酶誘導(dǎo)小鼠腦出血模型出血量。
　　第二部分：FGFR抑制FGF2引起

9、的FGFR激活對(duì)小鼠腦出血后腦損傷的影響
　　目的：研究FGFR抑制劑PD173074對(duì)FGFR激動(dòng)劑FGF2在小鼠腦出血后腦保護(hù)作用的影響。
　　方法：使用膠原酶誘導(dǎo)小鼠右基底節(jié)腦出血模型，小鼠腦出血后30分鐘隨機(jī)接受左側(cè)腦室微量注射FGF2100ng+PD1730740.1nmol、FGF2100ng+PD1730740.5nmol或FGF2100ng+25%DMSO/PBS治療。PD173074溶解于25%DMSO P

10、BS溶液中，F(xiàn)GF2100ng+25%DMSO/PBS治療組為PD173074治療對(duì)照組。腦出血后72小時(shí)，評(píng)測(cè)小鼠神經(jīng)功能評(píng)分，檢測(cè)腦水腫及腦組織對(duì)Evans Blue的通透性，western-blot方法檢測(cè)FGFR磷酸化水平。
　　結(jié)果：FGF2100ng+25%DMSO/PBS治療組與FGF2100ng治療組比較，小鼠神經(jīng)行為功能評(píng)分及腦水腫無(wú)顯著差異（P＞0.05），腦組織Evans Blue透過(guò)率無(wú)顯著差異（P＞0.0

11、5）。FGF2100ng+0.1nmol PD173074治療組與FGF2100ng+25%DMSO/PBS治療組比較，小鼠神經(jīng)行為功能缺損和腦水腫呈加重趨勢(shì)，但均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。FGF2100ng+0.5nmol PD173074治療組與FGF2100ng+25%DMSO/PBS治療組比較，F(xiàn)GFR磷酸化水平降低（P＜0.05），神經(jīng)行為功能評(píng)分損害加重（P＜0.05），右基底節(jié)區(qū)腦水腫升高（P＜0.05），腦組織Evan

12、s Blue透過(guò)率顯著升高（P＜0.05)。
　　結(jié)論： FGFR抑制劑抑制FGF2對(duì)FGFR的激活，逆轉(zhuǎn)FGF2對(duì)小鼠腦出血后的損傷的保護(hù)作用。
　　第三部分：FGFR下游通路PI3K/Akt-Rac1介導(dǎo)的RhoA抑制對(duì)小鼠腦出血后腦損傷的影響
　　目的：研究 FGFR激活保護(hù)小鼠腦出血后損傷所依賴的下游通路PI3K/Akt及Rac1激活對(duì)RhoA及內(nèi)皮細(xì)胞粘著連接的影響。
　　方法：第一節(jié)，使用膠原酶誘導(dǎo)小

13、鼠右基底節(jié)腦出血模型，雄性CD-1小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、PBS對(duì)照組、FGF2100ng治療組、FGF2100ng+25%DMSO/PBS治療組、FGF2100ng+PD1730740.5nmol治療組。收集腦出血后72小時(shí)腦組織，western-blot方法檢測(cè)各組Akt磷酸化水平，Rac1、RhoA活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組Rac1、RhoA活性，免疫共沉淀方法檢測(cè)粘著連接蛋白VE-cadherin-p120-catenin-β-cat

14、enin復(fù)合物水平。
　　第二節(jié)，PI3K抑制劑LY204002溶解于25%DMSO/PBS溶液中。使用膠原酶誘導(dǎo)小鼠右基底節(jié)腦出血模型，小鼠腦出血后30分鐘隨機(jī)接受左側(cè)腦室微量注射 FGF2100ng+LY29400250nmol或 FGF2100ng+25%DMSO/PBS治療。FGF2100ng+25%DMSO/PBS治療組為L(zhǎng)Y294002治療對(duì)照組。腦出血后72小時(shí)，進(jìn)行小鼠神經(jīng)功能評(píng)分，檢測(cè)腦水腫及腦組織對(duì)Evans

15、Blue的通透性，western-blot方法檢測(cè)Akt磷酸化水平，Rac1、RhoA活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組Rac1、RhoA活性，免疫共沉淀方法檢測(cè)粘著連接蛋白 VE-cadherin-p120-catenin-β-catenin復(fù)合物水平。
　　結(jié)果：第一節(jié)，對(duì)照組與假手術(shù)組比較，小鼠腦出血后72小時(shí)Rac1活性降低（P＜0.05），RhoA活性升高（P＜0.05），粘著連接蛋白復(fù)合物 VE-cadherin-p120-cat

16、enin-β-catenin水平降低（P＜0.05）。FGF2100ng治療組與PBS對(duì)照組比較，小鼠腦出血后72小時(shí)pAkt水平升高（P＜0.05)，Rac1活性升高（P＜0.05)，RhoA活性降低（P＜0.05)，VE-cadherin-p120-catenin-β-catenin復(fù)合物水平升高（P＜0.05）。FGF2100ng+25%DMSO/PBS治療組與FGF2100ng治療組比較，pAkt、Rac1活性、RhoA活性及V

17、E-cadherin-p120-catenin-β-catenin復(fù)合物水平無(wú)顯著差異。 FGF2100ng+PD1730740.5nmol治療組與 FGF2100ng+25%DMSO/PBS治療組比較，小鼠腦出血后72小時(shí)pAkt水平降低（P＜0.05)，Rac1活性降低（P＜0.05)，RhoA活性升高（P＜0.05)，VE-cadherin-p120-catenin-β-catenin復(fù)合物水平降低（P＜0.05）。
　　第

18、二節(jié)，F(xiàn)GF2100ng+LY29400250nmol治療組與 FGF2100ng+25%DMSO/PBS治療組比較，小鼠腦出血后72小時(shí)神經(jīng)行為功能評(píng)分損害加重（P＜0.05），腦水腫增加（P＜0.05），Evans Blue腦組織透過(guò)率升高（P＜0.05），pAkt水平降低（P＜0.05），Rac1活性降低（P＜0.05），RhoA活性升高（P＜0.05），VE-cadherin-p120-catenin-β-catenin復(fù)合物水

19、平降低（P＜0.05)。
　　結(jié)論：小鼠腦出血后pAkt水平無(wú)顯著改變，RhoA活性升高，Rac1活性降低，粘著連接蛋白VE-cadherin-p120-catenin-β-catenin復(fù)合物水平降低，血腦屏障破壞增加。FGF2激活FGFR，導(dǎo)致下游PI3K激活，pAkt升高，Rac1活性升高，抑制RhoA降低RhoA活性及其介導(dǎo)的粘著連接蛋白復(fù)合物降解，減少血腦屏障破壞。PD173074抑制FGF2誘導(dǎo)的FGFR激活，導(dǎo)致下游

20、PI3K抑制，pAkt降低，Rac1活性降低，RhoA活性升高，血腦屏障粘著連接蛋白復(fù)合物降解增加，逆轉(zhuǎn)FGF2的保護(hù)作用。抑制FGFR下游關(guān)鍵環(huán)節(jié)PI3K，pAkt降低，Rac1活性降低，RhoA活性升高，血腦屏障粘著連接蛋白復(fù)合物降解增加，F(xiàn)GF2激活FGFR對(duì)腦出血后的保護(hù)作用亦被逆轉(zhuǎn)。
　　第四部分：RhoA抑制對(duì)小鼠腦出血后腦損傷的影響
　　目的：研究抑制RhoA活性對(duì)小鼠腦出血后的保護(hù)作用。
　　方法：使用

21、Rho-kinase抑制劑Y27632抑制小鼠RhoA活性，Y27632溶解于PBS溶液中。雄性CD-1小鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組、PBS對(duì)照組和Y2763220nmol治療組。使用膠原酶注射誘導(dǎo)小鼠右基底節(jié)腦出血模型，小鼠腦出血后30分鐘接受左側(cè)腦室微量注射Y2763220nmol或PBS治療。腦出血后72小時(shí)，評(píng)測(cè)小鼠神經(jīng)功能評(píng)分，檢測(cè)腦組織含水量及腦組織對(duì)Evans Blue的通透性，RhoA活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)腦組織 RhoA活性，免

22、疫共沉淀及 western-blot方法檢測(cè)粘著連接蛋白VE-cadherin-p120-catenin-β-catenin復(fù)合物水平。
　　結(jié)果：Y2763220nmol治療組與對(duì)照組比較，小鼠腦出血后72小時(shí)RhoA活性降低（P＜0.05），VE-cadherin-p120-catenin-β-catenin復(fù)合物水平升高（P＜0.05），腦組織對(duì)Evans Blue透過(guò)性降低（P＜0.05），病側(cè)基底節(jié)區(qū)腦水腫降低（P＜0.