成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3在惡性黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、惡性黑色素瘤是極具侵襲性的皮膚惡性腫瘤之一，多發(fā)于歐美等發(fā)達(dá)國家。在美國，惡性黑色素瘤分別是發(fā)病率第五的男性惡性腫瘤(5％)和發(fā)病率第六的女性惡性腫瘤(4％)。對(duì)于亞洲國家而言，惡性黑色素瘤的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐美國家，大部分地區(qū)發(fā)病率不足1/10萬。在中國，惡性黑色素瘤并不是一種十分常見的惡性腫瘤，然而，由于人口基數(shù)大，惡性黑色素瘤的總體罹患人數(shù)較多，尤其在沿海發(fā)達(dá)城市，惡性黑色素瘤的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，應(yīng)引起足夠的重視。此

2、外，惡性黑色素瘤是一種早期轉(zhuǎn)移率極高的惡性腫瘤，預(yù)后很差，這也是該病致死率高的一個(gè)重要原因。惡性黑色素瘤病因復(fù)雜，目前已經(jīng)明確的惡性黑色素瘤致病因素有遺傳因素、日光暴露等環(huán)境因素以及電離輻射等因素。治療措施方面，臨床上以手術(shù)切除治療為主，輔以免疫療法、腫瘤靶向藥物治療等綜合措施，可改善大部分惡性黑色素瘤患者的疾病進(jìn)程。然而，上述治療措施對(duì)于轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤療效甚微，患者的五年生存率不足20％。因此，尋找新的診斷、治療手段對(duì)于提高惡性黑

3、色素瘤患者的預(yù)后具有重要意義。
　　成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）家族蛋白及其受體FGFR家族蛋白屬于經(jīng)典的酪氨酸激酶受體-配體信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。目前共有22種FGF和4種FGFR被發(fā)現(xiàn)和鑒定。FGFR家族蛋白在機(jī)體正常的血管形成、胚胎發(fā)育等過程發(fā)揮重要作用。FGFR3最早被認(rèn)為是一種骨骼發(fā)育的負(fù)向調(diào)控蛋白，F(xiàn)GFR3敲除的小鼠呈現(xiàn)長(zhǎng)骨發(fā)育過度的表型，而激活的FGFR3突變則被證實(shí)與

4、侏儒癥密切相關(guān)。近年來，過度激活的FGFR3信號(hào)被證實(shí)與骨髓瘤、宮頸癌、膀胱癌等惡性腫瘤密切相關(guān)，激活型FGFR3突變可以顯著增強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞的惡性行為，因此FGFR3被認(rèn)為是多種惡性腫瘤的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。FGF及其受體與惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，F(xiàn)GFR1是決定惡性黑色素瘤原位增生、血管新生和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵基因。FGFR4與惡性黑色素瘤的惡性程度正相關(guān)。考慮到FGFR家族蛋白在結(jié)構(gòu)上的同源性和功能上的相似性，闡明FGFR3

5、在惡性黑色素瘤中的表達(dá)情況、臨床意義和生物學(xué)功能可能具有重要的價(jià)值。
　　研究目的:
　　1、使用定量PCR技術(shù)明確FGFR3在惡性黑色素瘤組織和配對(duì)正常組織中的表達(dá)量。
　　2、檢測(cè)FGFR3在惡性黑色素瘤組織中的表達(dá)量與患者的臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系。
　　3、分別在惡性黑色素瘤細(xì)胞中敲低和過表達(dá)FGFR3，驗(yàn)證FGFR3對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。
　　4、驗(yàn)證FGFR3對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞的體外遷移、侵襲及上

6、皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)行為的調(diào)控作用。
　　5、探究FGFR3對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖、遷移的調(diào)控作用。
　　6、初步明確沉默F(xiàn)GFR3導(dǎo)致的惡性黑色素瘤細(xì)胞信號(hào)通路改變。
　　研究方法:
　　1、收集惡性黑色素瘤組織及其癌旁組織樣本42對(duì)，抽提RNA之后，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(Quantitative Real-time PCR，qR

7、T-PCR)檢測(cè)FGFR3在惡性黑色素瘤組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織的表達(dá)量。
　　2、免疫組化芯片技術(shù)檢測(cè)FGFR3在惡性黑色素瘤組織中的表達(dá)量，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度由低到高分為A、B、C、D四個(gè)等級(jí)，陽性細(xì)胞數(shù)分為A(＜10％)、B(10％-25％)、C(25％-50％)、D(＞50％)四個(gè)等級(jí)。采用染色強(qiáng)度的評(píng)分乘以陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分代表每個(gè)樣本最終的評(píng)分，0-3分代表FGFR3低表達(dá)，4-9代表高表達(dá)。
　　

8、3、采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得穩(wěn)定敲低FGFR3的細(xì)胞株A375/LV-shFGFR3和對(duì)照細(xì)胞株A375/LV-control。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得高表達(dá)FGFR3的細(xì)胞株A375/pcDNA3.0-FGFR3和對(duì)照細(xì)胞株A375/pcDNA3.0，采用qPCR技術(shù)分別驗(yàn)證mRNA水平的敲低效率和過表達(dá)效率。
　　4、采用CCK-8技術(shù)檢測(cè)FGFR3對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。使用適量胰酶消化細(xì)胞后，用培養(yǎng)液重懸，反復(fù)吹打均勻，將

9、其濃度調(diào)整為1000細(xì)胞/100微升。各組細(xì)胞分別取100ul細(xì)胞懸液置于96孔板中，每天相同時(shí)刻加入10ul CCK-8，4h后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，連續(xù)檢測(cè)6天。
　　5、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FGFR3對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞凋亡率的影響。A375/LV-shFGFR3和A375/LV-control細(xì)胞經(jīng)AnnexinⅤ和PI染色后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡率差異。
　　6、采用transwell小室和matrigel inv

10、asion chambers分別檢測(cè)FGFR3對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞遷移、侵襲的調(diào)控作用。
　　7、A375/LV-shFGFR3和A375/LV-control細(xì)胞分別注射入4周齡裸鼠右側(cè)腋下，每周檢測(cè)腫瘤體積變化，5周后將裸鼠處死，對(duì)比兩組皮下移植瘤的大小和重量。兩組細(xì)胞分別經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)，兩個(gè)月后對(duì)比兩組裸鼠肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)目。
　　8、采用Western blot技術(shù)檢測(cè)A375/LV-shFGFR33和A375

11、/LV-control細(xì)胞各自的ERK、AKT、EGFR等關(guān)鍵信號(hào)通路蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá)量。
　　研究結(jié)果:
　　1、FGFR3在惡性黑色素瘤組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。FGFR3在惡性黑色素瘤組織中的表達(dá)量與Breslow厚度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　2、慢病毒干擾FGFR3的表達(dá)之后，A375細(xì)胞增殖活力降低，質(zhì)粒過表達(dá)FGFR3之后，A375細(xì)胞的增殖活力升高。
　　3、沉默F(xiàn)GFR3顯著增加惡性黑

12、色素瘤細(xì)胞的凋亡率，過表達(dá)FGFR3降低其凋亡率。
　　4、慢病毒干擾FGFR3的表達(dá)之后，惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的遷移、侵襲能力降低，而FGFR3表達(dá)質(zhì)?？稍鰪?qiáng)惡性黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　5、沉默F(xiàn)GFR3可以顯著降低惡性黑色素瘤細(xì)胞的體內(nèi)增殖、遷移能力。
　　6、沉默F(xiàn)GFR3增加上皮性標(biāo)志物E-cadherin、Laminin的表達(dá)量，降低間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、vimentin等的表達(dá)量