Pin1在人惡性黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中作用研究Pin1抑制劑的篩選及機(jī)制研究XLN306的抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、惡性黑色素瘤是一種起源于黑色素細(xì)胞惡性度極高的皮膚腫瘤,近年來其發(fā)病率逐年攀升。早期發(fā)現(xiàn)的惡性黑色素瘤可以通過手術(shù)治愈,但一旦進(jìn)入快速生長(zhǎng)期,它能夠迅速擴(kuò)散到機(jī)體多個(gè)器官,預(yù)后差,死亡率非常高。目前,國(guó)際上尚沒有系統(tǒng)有效的治療方案能夠延長(zhǎng)患者的生存期。所以,深入探討惡性黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制,尋找基于病因?qū)W的潛在分子靶點(diǎn),對(duì)惡性黑色素瘤的治療具有重要意義。
　　 蛋白磷酸化絲/蘇-脯氨酸的異構(gòu)調(diào)節(jié)是繼蛋白磷酸化后一個(gè)新的調(diào)節(jié)機(jī)制,主

2、要關(guān)系到細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化。其關(guān)鍵酶——人肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(Pin1),能夠特異識(shí)別并催化磷酸化絲/蘇-脯氨酸模序發(fā)生異構(gòu),導(dǎo)致蛋白由順式變?yōu)榉词?調(diào)節(jié)其功能。研究表明,Pin1在多種人類腫瘤中過表達(dá),它參與整合并放大多種致癌信號(hào),被稱為腫瘤發(fā)生發(fā)展的“催化分子”。Bao等人的研究表明,Pin1在惡性黑色素瘤中呈過度表達(dá),但Pin1是否促進(jìn)了惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展,抑制Pin1是否能抑制惡性黑色素瘤的進(jìn)程,仍不得而知。
　　 因

3、此,本實(shí)驗(yàn)中選取惡性度和侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞株作為研究對(duì)象,采用人工構(gòu)建的miRNA質(zhì)粒特異沉默Pin1基因的表達(dá),從體內(nèi)、外水平檢測(cè)了Pin1基因沉默對(duì)A375細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等能力的影響。
　　 首先,通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,用Western Blot方法,從Invitrogen公司提供的4條miRNA質(zhì)粒中挑選了一條沉默效率最高的質(zhì)粒--miRNA plas4。繼而,通過miRNA plas4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A37

4、5細(xì)胞,得到了兩株穩(wěn)定沉默Pin1的單克隆細(xì)胞株,相對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照的克隆株--Mock,其沉默效率分別為85％和84％。
　　 為了闡明Pin1是否參與了人惡性黑色素瘤的增殖過程,通過體外生長(zhǎng)曲線法與腫瘤細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn),觀察了沉默Pin1對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響。研究結(jié)果表明,穩(wěn)定沉默Pin1的A375細(xì)胞,生長(zhǎng)速度明顯減慢,集落形成能力也大大降低。這說明Pin1確實(shí)對(duì)A375的增殖起到了促進(jìn)作用。另外,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

5、的細(xì)胞周期結(jié)果也顯示,穩(wěn)定沉默Pin1的兩株克隆,均出現(xiàn)了G0/G1期阻滯。
　　 由于惡性黑色素瘤是一種高侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤,也正是由于其高侵襲轉(zhuǎn)移性導(dǎo)致了患者高死亡率及預(yù)后不良,所以,為了探討Pin1是否與惡性黑色素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān),我們親本A375細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照細(xì)胞--Mock、以及兩株穩(wěn)定沉默Pin1的細(xì)胞,進(jìn)行了體外粘附實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)與穿膜試驗(yàn)。結(jié)果表明,沉默細(xì)胞中的Pin1,可以顯著降低A375細(xì)胞的異質(zhì)粘附

6、、運(yùn)動(dòng)以及侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 為了在體內(nèi)水平進(jìn)一步探討Pin1的作用,用Mock以及兩株穩(wěn)定沉默Pin1的克隆進(jìn)行了裸鼠異體移植瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,沉默細(xì)胞中的Pin1可以顯著降低A375細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤性。
　　 最后,為了從分子水平上闡明沉默Pin1所發(fā)揮的這些效應(yīng),究竟是源于對(duì)哪些原癌蛋白的抑制,采用Western Blot的方法,初步檢測(cè)了一些曾報(bào)道或未報(bào)道過的與Pin1相關(guān)的蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在穩(wěn)定

7、沉默Pin1的兩株克隆中,與腫瘤惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的pAkt(Ser473)/Akt比值明顯降低,JNK水平、MMP-2酶原水平明顯降低,而克隆2中原癌蛋白Her2和CyclinD1的表達(dá)水平也顯著降低。
　　 綜上所述,Pin1與人惡性黑色素瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),沉默細(xì)胞中的Pin1,可以同時(shí)抑制多種與腫瘤惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的原癌蛋白,從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,Pin1很可能成為一個(gè)新的治療惡性黑色素瘤的靶點(diǎn)。