Tiam1及Nm23-h1在惡性黑色素瘤中的表達.pdf

1、背景及目的：
　　惡性黑色素瘤簡稱惡黑（Malignant Melanoma，MM），是一種高度惡性腫瘤。其主要起源于黑色素細胞，多見于皮膚及粘膜。皮膚惡性黑色素瘤（Cutaneous Malignant Melanoma，CMM)與其他體表腫瘤相比，侵襲及轉(zhuǎn)移最具特征性，也是影響患者預后最重要的原因。CMM侵襲轉(zhuǎn)移機制異常復雜，是由多種致病因素、多個發(fā)病步驟及階段共同作用的結(jié)果。Liotta提出的惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的三步假說即粘附

2、、降解、移動。包括原發(fā)灶處腫瘤細胞的脫落，通過各種作用機制進入血運及淋巴管中播散，隨后在其他器官組織處粘附，之后通過分泌相關因子加速新生血管生成并增強腫瘤細胞對機體免疫系統(tǒng)的對抗作用，最終形成新的惡性腫瘤病灶。目前各項有關研究表明其中尤為重要的因素是其相關癌基因的激活及其抑癌基因表達降低或消失，引起癌細胞增殖及侵襲能力增強而致病。因此針對惡黑的各種癌基因及抑癌基因作為靶點的基因治療逐漸成為一個有效治療方法。
　　T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘

3、導因子1（T lymphoma invasion and metastasis inducing factor1,Tiam1）編碼的Tiam1蛋白是一系列Roh樣GTPase的鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子（guanine nucleotide exchange factor,GEF）。Tiam1主要能參與GDP與GTP的轉(zhuǎn)化過程中，從而進一步影響微管蛋白的聚合和解聚；另外進一步激活Rac1(Ras相關的C3肉毒素底物1),參與JNK激酶（c-jun

4、N-terminal kinase）、p38 MAPK激酶（mitogen activated protein kinase）等下游信號分子轉(zhuǎn)導。通過上述作用機制對機體的細胞骨架進行調(diào)節(jié)，參與細胞的形變及偽足的形成，增強細胞的運動、遷移能力。同時對微管蛋白進行調(diào)控并與其他基因協(xié)同作用共同影響細胞的增殖與凋亡。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。
　　轉(zhuǎn)移抑制因子23(non-metastasis23 homologu

5、e1,Nm23-h1)基因是近來研究較多的一個基因。Nm23-h1的生物活性主要通過其編碼蛋白產(chǎn)物核苷二磷酸激酶(NDPK)來實現(xiàn)。NDPK一方面直接參與微管蛋白的聚合與解聚從而調(diào)節(jié)細胞有絲分裂及細胞運動；另一方面NDPK通過多種方式參與G蛋白的信號轉(zhuǎn)導通路，介導細胞的增殖與形態(tài)變化；另外其與 Rho家族成員廣泛藕聯(lián)，通過對下游基因的表達調(diào)控來影響腫瘤細胞的增殖及浸潤。
　　本實驗通過RT-PCR法了解Tiam1及Nm23-h1在

6、A375細胞和正常皮膚組織細胞中的轉(zhuǎn)錄水平差異，利用免疫組化方法檢測Tiam1及Nm23-h1蛋白在皮膚惡性黑色素瘤、皮膚交界痣和正常皮膚組織中的表達。初步探究其與惡性黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的相關性，并進一步了解Tiam1與Nm23-h1之間的相關作用。此次研究在于揭示Tiam1及Nm23-h1在惡性黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的變化規(guī)律，為臨床基因靶向治療惡黑提供實驗依據(jù)。
　　材料與方法：
　　采用RT-PCR法檢測Tiam1

7、及Nm23-h1mRNA在A375細胞及正常皮膚組織細胞中的轉(zhuǎn)錄水平差異。運用 SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，運用 t檢驗法，有統(tǒng)計學意義的α=0.05，P<0.05。
　　收集2010～2014年期間鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科存檔的皮膚惡性黑色素瘤蠟塊66例，交界痣30例。年齡22～76歲不等，平均年齡58.8±9.2歲；男性36例，女性30例；對照組所采用的正常皮膚組織20例來自于鄭州大學第一附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)

8、切除的多余正常全厚皮膚組織。以上所有實驗對象具有完整的病史資料，無相關疾病病史，也未行相關如冷凍、化學藥物、激光及放射等治療。各組患者性別、年齡及病變部位等差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。66例CMM、30例皮膚交界痣和20例正常皮膚組織中Tiam1及Nm23-h1蛋白的表達水平采用免疫組化法進行檢測。采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，運用卡方檢驗和 pearson法相關性分析，有統(tǒng)計學意義的α=0.05， P<0.0

9、5。
　　結(jié)果：
　　1.人正常皮膚組織及人惡性黑色素瘤A375細胞中Tiam1 mRNA相對表達量分別為1.001±0.074、2.546±0.357，正常皮膚組織及 A375細胞中 Nm23-h1 mRNA相對表達量分別為0.999±0.034、0.953±0.022。Tiam1 mRNA在人惡性黑色素瘤A375細胞中的表達明顯高于其在人正常皮膚組織中的表達；Nm23-h1 mRNA在人惡性黑色素瘤 A375細胞中的表達

10、低于其在人正常皮膚組織中的表達，其差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　2.Tiam1蛋白主要表達于細胞質(zhì)，呈棕褐色顆粒。Tiam蛋白在CMM、皮膚交界痣及正常皮膚組中陽性表達率分別為78.79％(52/66)、46.67%(14/30)和10.00%(2/20)，呈逐漸降低趨勢，差異具有統(tǒng)學意義(P<0.05)。三組間兩兩比較顯示：CMM組中Tiam1蛋白陽性表達明顯高于其在皮膚交界痣中的陽性表達，其在交界痣的表達明顯高于

11、正常皮膚組織中的表達(P<0.05)；在CMM中隨腫瘤浸潤深度的增加Tiam1蛋白的陽性表達也逐漸增高，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CMM患者中 Tiam1蛋白表達水平高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，并且差異均具有統(tǒng)計意義（P<0.05)。
　　3.Nm23-h1蛋白主要表達于細胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒狀。Nm23-h1蛋白在CMM、皮膚交界痣及正常皮膚組中陽性表達率為15.15%（10/66）、44.67%（14/30）和80.00%（16/20）。

12、Nm23-h1蛋白在CMM、皮膚交界痣及正常皮膚中表達逐漸增強，其在三組中的陽性表達率差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），三組間兩兩比較顯示： CMM組中Nm23-h1蛋白陽性表達明顯低于其在皮膚交界痣中的陽性表達，其在交界痣的表達明顯低于正常皮膚組織中的表達(P<0.05)；在 CMM中隨腫瘤浸潤深度的增加Nm23-h1蛋白的陽性表達也逐漸降低，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CMM患者中Nm23-h1蛋白表達水平低于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，并且差異均

13、具有統(tǒng)計意義（P<0.05)。
　　4.Tiam1及Nm23-h1蛋白表達的相關性分析：Tiam1蛋白的表達與Nm23-h1蛋白的表達均呈負相關（r=-0.298, P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.Tiam1在惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中存在促進作用。
　　2.Nm23-h1在惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定的抑制作用。
　　3.Tiam1、Nm23-h1可能作為治療惡性黑色素瘤的基因靶點，為惡