鼻咽癌中Pin1異構(gòu)酶的作用及其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子ATF1的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的：⑴研究Pin1異構(gòu)酶啟動(dòng)子單核苷酸多態(tài)性（-842G＞C，rs2233678和-667T＞C，rs2233679）與鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和臨床資料的關(guān)系；⑵研究Pin1異構(gòu)酶調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子ATF1對(duì)鼻咽細(xì)胞惡性表型的影響以及Pin1異構(gòu)酶對(duì)ATF1的調(diào)節(jié)作用。旨在為鼻咽癌早期的基因型診斷以及靶向治療提供科學(xué)依據(jù)，尋求鼻咽癌防治新的靶點(diǎn)。
　　 方法：①收集178位鼻咽癌病人及156位正常對(duì)照人群血細(xì)胞標(biāo)本，采用天根公司的“血液、組

2、織、細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒”，按照試劑盒具體步驟進(jìn)行提取DNA，將包含兩個(gè)SNP位點(diǎn)的DNA通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)方法判定基因型，并隨機(jī)抽取一定比例（約20例）的樣品用測(cè)序的方法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)鼻咽癌病人及正常人兩個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型分布差異及關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，應(yīng)用擬合優(yōu)度x2檢驗(yàn)對(duì)對(duì)照組基因型頻率分布行Hardy-Weinberg平衡分析。p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②培養(yǎng)人鼻咽癌高分

3、化細(xì)胞株CNE-1和低分化細(xì)胞株CNE-2Z細(xì)胞，構(gòu)建Pin1及ATF1的真核表達(dá)載體及mU6Pro siRNA-Pin1干擾載體。將Pin1及ATF1的真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染或共同轉(zhuǎn)染到CNE-1細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆;將Pin1及ATF1的mU6Pro siRNA干擾載體分別轉(zhuǎn)染或共同轉(zhuǎn)染到CNE-2Z細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆。用瞬間轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所得的細(xì)胞以及Pin1抑制劑Juglone處理后的細(xì)胞通過(guò)CCK8法、克隆

4、形成實(shí)驗(yàn)、Chamber invasionassay、流式細(xì)胞分析檢測(cè)細(xì)胞體外致瘤能力改變。用蛋白質(zhì)免疫共沉淀及共聚焦實(shí)驗(yàn)分析Pin1和磷酸化ATF1是否可能在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用及共定位。采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，對(duì)ATF1轉(zhuǎn)錄活性是否受Pin1異構(gòu)酶調(diào)節(jié)進(jìn)行了分析，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：⑴對(duì)照組基因型頻率分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析(p=0.056

5、for-667T＞C and p=0.063 p＞0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群代表性。⑵在-667T＞C，rs2233679位點(diǎn)，攜帶雜合子CT或者CC基因型的人患有鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)低于攜帶純合子TT基因型的人(OR=0.639，95％ CI=0.452-0.903，p=0.011 for-667CT; and OR=0.441,95％ CI=0.213-0.915,p=0.038 for-667CC,r

6、espectively)。在-842G＞C位點(diǎn)，攜帶GC雜合子的人患鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)明顯比攜帶GG純合子基因的人要低(OR=0.465，95％ CI=0.249-0.871，p=0.010)。但是CC純合子與GG純合子相比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著。⑶對(duì)于病例組-667T＞C，rs2233679和-842G＞C，rs2233678兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的臨床資料進(jìn)行分組分析，發(fā)現(xiàn)年齡、性別、TNM臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各分組中差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)

7、。⑷免疫組織化學(xué)結(jié)果:Pin1和pATF1(ser63)均在鼻咽癌組織中高表達(dá)，而在非瘤性鼻咽組織（癌旁組織、慢性炎癥及正常鼻咽組織）中均低表達(dá)。⑸激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Pin1和ser63位點(diǎn)磷酸化的ATF1可能存在細(xì)胞內(nèi)共定位現(xiàn)象。⑹Western blot證實(shí):Pin1和ser63位點(diǎn)磷酸化的ATF1存在相互免疫共沉淀，提示二者可能存在細(xì)胞內(nèi)相互作用。⑺CCK8結(jié)果顯示:Pin1穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞與對(duì)照相比，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。⑻

8、細(xì)胞周期分析:Pin1穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞與對(duì)照相比G1、G2期明顯增多，S期明顯減少。⑼平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Juglone對(duì)CNE-2Z細(xì)胞平板克隆形成能力有明顯抑制作用，且隨著劑量增加而逐漸增強(qiáng);瞬間轉(zhuǎn)染Pin1或ATF1的鼻咽癌細(xì)胞克隆形成能力增強(qiáng)。共轉(zhuǎn)Pin1及ATF1組，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染Pin1組相比，克隆形成能力增強(qiáng)明顯，差異有顯著性;但與單獨(dú)轉(zhuǎn)染ATF1組相比，克隆形成能力沒(méi)有明顯增強(qiáng)。⑽CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Pin1抑制劑Jugl

9、one能明顯抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖，隨著Juglone濃度的增加對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖抑制越明顯。⑾Chamber invasion assay結(jié)果顯示juglone抑制CNE-2Z細(xì)胞的侵襲能力也存在明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。⑿Western blot結(jié)果:Pin1抑制劑juglone處理CNE-2Z細(xì)胞后，ATF1磷酸化水平隨著juglone濃度的增加而減少;而鼻咽癌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)Pin1后ATF1表達(dá)水平也會(huì)增加。⒀轉(zhuǎn)錄因子ATF1熒光

10、素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示:Pin1穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，熒光素酶活性明顯增加。
　　 結(jié)論：①Pin1異構(gòu)酶啟動(dòng)子單核苷酸多態(tài)性（-842G＞C，rs2233678和-667T＞C，rs2233679）與鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)系。在-667T＞C，rs2233679位點(diǎn)，攜帶純合子TT基因型的人患病風(fēng)險(xiǎn)更高。在-842G＞C位點(diǎn)，攜帶GC雜合子的人患鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)更高些。②Pin1異構(gòu)酶啟動(dòng)子單核苷酸多態(tài)性（-842G＞C，rs22