鼻咽癌中Pin1異構(gòu)酶的作用及其對轉(zhuǎn)錄因子ATF1的調(diào)控機制.pdf

1、目的：⑴研究Pin1異構(gòu)酶啟動子單核苷酸多態(tài)性（-842G＞C，rs2233678和-667T＞C，rs2233679）與鼻咽癌發(fā)病風險和臨床資料的關(guān)系；⑵研究Pin1異構(gòu)酶調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子ATF1對鼻咽細胞惡性表型的影響以及Pin1異構(gòu)酶對ATF1的調(diào)節(jié)作用。旨在為鼻咽癌早期的基因型診斷以及靶向治療提供科學依據(jù)，尋求鼻咽癌防治新的靶點。
　　 方法：①收集178位鼻咽癌病人及156位正常對照人群血細胞標本，采用天根公司的“血液、組

2、織、細胞基因組DNA提取試劑盒”，按照試劑盒具體步驟進行提取DNA，將包含兩個SNP位點的DNA通過限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)方法判定基因型，并隨機抽取一定比例（約20例）的樣品用測序的方法進行結(jié)果驗證。應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對鼻咽癌病人及正常人兩個SNP位點的基因型分布差異及關(guān)聯(lián)性進行分析，應用擬合優(yōu)度x2檢驗對對照組基因型頻率分布行Hardy-Weinberg平衡分析。p＜0.05具有統(tǒng)計學意義。②培養(yǎng)人鼻咽癌高分

3、化細胞株CNE-1和低分化細胞株CNE-2Z細胞，構(gòu)建Pin1及ATF1的真核表達載體及mU6Pro siRNA-Pin1干擾載體。將Pin1及ATF1的真核表達載體分別轉(zhuǎn)染或共同轉(zhuǎn)染到CNE-1細胞，篩選出穩(wěn)定表達的細胞克隆;將Pin1及ATF1的mU6Pro siRNA干擾載體分別轉(zhuǎn)染或共同轉(zhuǎn)染到CNE-2Z細胞，篩選出穩(wěn)定表達的細胞克隆。用瞬間轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所得的細胞以及Pin1抑制劑Juglone處理后的細胞通過CCK8法、克隆

4、形成實驗、Chamber invasionassay、流式細胞分析檢測細胞體外致瘤能力改變。用蛋白質(zhì)免疫共沉淀及共聚焦實驗分析Pin1和磷酸化ATF1是否可能在細胞內(nèi)存在相互作用及共定位。采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)，對ATF1轉(zhuǎn)錄活性是否受Pin1異構(gòu)酶調(diào)節(jié)進行了分析，應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)。p＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：⑴對照組基因型頻率分布進行Hardy-Weinberg平衡分析(p=0.056

5、for-667T＞C and p=0.063 p＞0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群代表性。⑵在-667T＞C，rs2233679位點，攜帶雜合子CT或者CC基因型的人患有鼻咽癌的風險低于攜帶純合子TT基因型的人(OR=0.639，95％ CI=0.452-0.903，p=0.011 for-667CT; and OR=0.441,95％ CI=0.213-0.915,p=0.038 for-667CC,r

6、espectively)。在-842G＞C位點，攜帶GC雜合子的人患鼻咽癌風險明顯比攜帶GG純合子基因的人要低(OR=0.465，95％ CI=0.249-0.871，p=0.010)。但是CC純合子與GG純合子相比較統(tǒng)計學差異不顯著。⑶對于病例組-667T＞C，rs2233679和-842G＞C，rs2233678兩個多態(tài)性位點的臨床資料進行分組分析，發(fā)現(xiàn)年齡、性別、TNM臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各分組中差別均無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)

7、。⑷免疫組織化學結(jié)果:Pin1和pATF1(ser63)均在鼻咽癌組織中高表達，而在非瘤性鼻咽組織（癌旁組織、慢性炎癥及正常鼻咽組織）中均低表達。⑸激光共聚焦實驗結(jié)果顯示:Pin1和ser63位點磷酸化的ATF1可能存在細胞內(nèi)共定位現(xiàn)象。⑹Western blot證實:Pin1和ser63位點磷酸化的ATF1存在相互免疫共沉淀，提示二者可能存在細胞內(nèi)相互作用。⑺CCK8結(jié)果顯示:Pin1穩(wěn)定表達的細胞與對照相比，細胞增殖能力明顯增強。⑻

8、細胞周期分析:Pin1穩(wěn)定表達的細胞與對照相比G1、G2期明顯增多，S期明顯減少。⑼平板克隆實驗結(jié)果顯示:Juglone對CNE-2Z細胞平板克隆形成能力有明顯抑制作用，且隨著劑量增加而逐漸增強;瞬間轉(zhuǎn)染Pin1或ATF1的鼻咽癌細胞克隆形成能力增強。共轉(zhuǎn)Pin1及ATF1組，與單獨轉(zhuǎn)染Pin1組相比，克隆形成能力增強明顯，差異有顯著性;但與單獨轉(zhuǎn)染ATF1組相比，克隆形成能力沒有明顯增強。⑽CCK8實驗結(jié)果表明，Pin1抑制劑Jugl

9、one能明顯抑制CNE-2Z細胞增殖，隨著Juglone濃度的增加對CNE-2Z細胞增殖抑制越明顯。⑾Chamber invasion assay結(jié)果顯示juglone抑制CNE-2Z細胞的侵襲能力也存在明顯劑量效應關(guān)系。⑿Western blot結(jié)果:Pin1抑制劑juglone處理CNE-2Z細胞后，ATF1磷酸化水平隨著juglone濃度的增加而減少;而鼻咽癌細胞中穩(wěn)定表達Pin1后ATF1表達水平也會增加。⒀轉(zhuǎn)錄因子ATF1熒光

10、素酶報告基因結(jié)果顯示:Pin1穩(wěn)定表達的細胞與對照細胞相比，熒光素酶活性明顯增加。
　　 結(jié)論：①Pin1異構(gòu)酶啟動子單核苷酸多態(tài)性（-842G＞C，rs2233678和-667T＞C，rs2233679）與鼻咽癌發(fā)病風險有關(guān)系。在-667T＞C，rs2233679位點，攜帶純合子TT基因型的人患病風險更高。在-842G＞C位點，攜帶GC雜合子的人患鼻咽癌風險更高些。②Pin1異構(gòu)酶啟動子單核苷酸多態(tài)性（-842G＞C，rs22